Browsing by Author "Söllner, Stefan"

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    Konstruktion von Escherichia coli Produktionsstämmen zur fermentativen Herstellung von Succinat aus Glycerin
    (2012) Söllner, Stefan; Mattes, Ralf (Prof. Dr.)
    Glycerin fällt in großen Mengen bei der Biodieselproduktion an und kann als billiger, nachwachsender Rohstoff betrachtet werden, aus dem sich biotechnologisch viele industriell relevante Fein- oder Bulkchemikalien herstellen lassen. Eine der Bulkchemikalien ist Succinat, das Anion der Bernsteinsäure, welche in Studien des Department of Energy der USA (DOE) in den Jahren 2004 und 2010 als wichtige Plattformchemikalie bezeichnet wurde. Plattformchemikalien bzw. chemische Bausteine können kostengünstig in eine Vielzahl von weiteren, höherpreisigen Materialien umgewandelt werden. In dieser Arbeit wurden Escherichia coli Produktionsstämme für Succinat konstruiert. Die Bildung größerer Zellmassen erfolgte vor der Produktionsphase in einer aeroben Wachstumsphase in Minimalmedium mit Glycerin als C-Quelle. In der mikroaeroben oder anaeroben Produktionsphase wurde dann wachstumsentkoppelt Succinat aus Glycerin und Kohlenstoffdioxid bzw. Hydrogencarbonat gebildet. Die Entstehung von 1 mol Succinat aus 1 mol Glycerin unter Fixierung von 1 mol CO2 ist redoxneutral und stellt die theoretisch maximale Succinatausbeute dar. Zuerst wurde eine Methode entwickelt, um die Succinatproduktion verschiedener Stämme schnell und einfach miteinander vergleichen zu können. Diese Biotransformationen im Kleinmaßstab wurden in 1,5 ml Plastikgefäßen durchgeführt. Zuvor wurden diese mit 1,2 ml einer Zellsuspension von 0,5 OD600/ml in M9-Minimalmedium gefüllt, welches definierte Mengen Glycerin und Hydrogencarbonat enthielt. Anschließend wurde der zeitliche Verlauf der Zelldichte und der exkretierten Metabolite gemessen. Nach einem anfänglichen, kleinen Anstieg der Zelldichte auf durchschnittlich 0,7 OD600/ml blieb diese während des Produktionszeitraumes bis zu 15 Tage konstant. In einem Experiment wurde der Einbau von 13C-markiertem Hydrogencarbonat in das gebildete Succinat per Massenspektrometrie bestätigt. Verschiedene Stoffwechselwege führen zum Succinat. Aus diesen Wegen wurden drei Strategien zur Succinatproduktion abgeleitet, wobei jede Strategie eine Kombination mehrerer Wege beinhaltete. Der metabolische Fluß über bestimmte Wege wurde durch die Deletion von Genen mit der λRed-Rekombinationsmethode oder durch Plasmid-basierte Expression von Genen, die für auf den jeweiligen Routen benötigte Enzyme codieren, begünstigt. Außerdem sollten die Deletionen die Entstehung von Nebenprodukten wie beispielsweise Acetat verhindern. Nach der ersten Strategie sollte Succinat durch PEP-Carboxylierung und über den Glyoxylatzyklus produziert werden. Dem Stamm ss328 (ΔackA-pta ΔmgsA ΔgldA ΔtdcE ΔldhA ΔpoxB ΔpflB) fehlt der Großteil der Pyruvat-verbrauchenden Enzyme. Zusätzlich wurde die Acetatentstehung verhindert. Stamm ss328 verbrauchte bei einer Biotransformation mit 0,5 OD600/ml Zellen innerhalb von 6 Tagen 43,2 ± 5,7 mM Glycerin und bildete 28,1 ± 3,3 mM Succinat. Dies entsprach einer molaren Succinatausbeute von 65,1 ± 1,4 %. Nach der zweiten Strategie sollte Succinat neben PEP-Carboxylierung vor allem durch Pyruvat-Carboxylierung gebildet werden. Stamm ss331 (ΔlipA ΔldhA ΔpoxB ΔpflB) kann viele Pyruvat-verbrauchende Enzyme nicht mehr synthetisieren. Außerdem ist wegen ΔlipA der Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex inaktiv, falls keine Liponsäure zugegeben wird. ss331 wurde mit Plasmid pSS84.4 transformiert, welches das Gen für das Malic-Enzym 2 von Arabidopsis thaliana trug. Der resultierende Stamm verbrauchte bei einer Biotransformation mit 0,5 OD600/ml Zellen innerhalb von 6 Tagen 37,6 ± 1,4 mM Glycerin und bildete 26,6 ± 0,7 mM Succinat. Dies kam einer molaren Succinatausbeute von 70,9 ± 0,7 % gleich. Nach der dritten Strategie sollte Succinat ausschließlich durch PEP-Carboxylierung entstehen, weswegen die Gene pykA und pykF, die für Pyruvatkinasen codieren, deletiert wurden. Die Pyruvatkinasen katalysieren die direkte Umwandlung von PEP in Pyruvat. Die erhaltenen Stämme konnten auf Glycerin kaum wachsen, da sie nur ungenügende Mengen Pyruvat bilden konnten. Erst nach einer Selektion auf schnelleres Wachstum in Minimalmedium mit Glycerin zeigten die erhaltenen Mutanten Wachstumsraten im Bereich von 0,3 h-1. Pyruvat wurde in diesen Stämmen vermutlich verstärkt über die POMP-Umleitung gebildet, welche folgende Schritte beinhaltet: PEP-Carboxylierung zum Oxalacetat, Umwandlung von Oxalacetat in Malat und Decarboxylierung von Malat zum Pyruvat. Mit dem Stamm ss279 (ΔgldA ΔtdcE ΔpykA ΔpykF ΔldhA ΔpoxB ΔpflB) wurde in Biotransformationen mit 0,5 OD600/ml Zellen innerhalb von 6 Tagen 57,8 ± 2,8 mM Glycerin verbraucht und 47,1 ± 1,1 mM Succinat gebildet. Dies entsprach einer molaren Succinatausbeute von 81,5 ± 2,0 %. Berücksichtigt man nur den reinen Produktionszeitraum ohne Zellmassebildung ab dem zweiten Tag, so wurden noch höhere Ausbeuten von 89,5 ± 3,7 % erhalten.