Browsing by Author "Schindler, Petra T."

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Open Access
Proteomics und molekularbiologische Analyse der zellfreien Proteinbiosynthese
(2000) Schindler, Petra T.; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing.)
Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe bioanalytischer Methoden und Proteomanalysen eine eingehende Diagnose der Limitationen der zellfreien Proteinbiosynthese durchzuführen. Bei den Untersuchungen wurden ausschliesslich S30 Zellextrakte von Escherichia coli eingesetzt. Langfristiges Ziel soll dabei die Therapie der identifizierten Begrenzungen der in vitro Biosynthese sein, um schliesslich die Produktkonzentrationen und Raum-Zeitausbeuten für die synthetisierten Proteine zu verbessern. Durch quantitative Analysen wurde gezeigt, dass die Energieversorgung der zellfreien Biosynthese durch das Energieregenerierungssystem von Acetatkinase/Acetylphosphat nicht limitierend für die Proteinbiosynthese ist. Mit hochauflösender zweidimensionaler Elektrophorese (2DE) plus Sequenzanalysen konnten Elongationsfaktoren und ribosomale Proteine identifiziert werden, jedoch lagen diese essentiellen Proteine im Verlauf der Proteinbiosynthese zum Teil in unterschiedlichen Isoformen vor. Offensichtlich stehen also Zustandsänderungen der Lysatproteine im Zusammenhang mit der Translationsaktivität eines zellfreien Lysates. So wurde festgestellt, dass sich das Phosphorylierungsmuster mit der translationalen Aktivität des zellfreien Lysates ändert. In inaktiven Lysaten konnten kaum Modifizierungen dieser Art gefunden werden, während in aktiven Lysaten essentielle Proteine phosphoryliert waren. Zeitgleich mit dem Zusammenbruch der zellfreien Synthese im Batch-Verfahren haben die meisten dieser Proteine ihre Modifikation verloren. Allein von EF-Tu war bisher bekannt, dass eine Phosphorylierung an Threonin 382 essentiell ist. Aufgrund weiterer Messungen konnte ausgeschlossen werden, dass die Energie- oder Substratversorgung des zellfreien Systems sowie die Transkription den Zusammenbruch nach 50min Batch-Reaktion herbeiführen. Als die Biosynthese potentiell limitierender Faktor zeigte sich die Änderung des Modifizierungsmusters der Lysatproteine und damit der vorhandenen Aktivität und Funktion.