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Open Access
Entwicklung von Werkzeugen zur Darstellung und Durchmusterung von Proteinbibliotheken
(1999) Enzelberger, Markus; Schmid, Rolf (Prof. Dr.)
Die Zufallsmutagenese etabliert sich zunehmend als Methode zur Veränderung von Proteineigenschaften. In der vorliegenden Arbeit werden Methoden zur automatisierten Erstellung und Durchmusterung von so erzeugten Proteinbibliotheken beschrieben. Um die Durchmusterung der Bibliotheken mit Roboterunterstützung durchführen zu können, wurde ein Verfahren entwickelt, welches die Vereinzelung der Mutanten in Mikrotiterplatten erlaubt. Zu diesem Zweck wurde ein Vektor konstruiert, welcher neben dem mutierten Gen noch das green fluorescent Protein (gfp) trägt. Mit diesem Vektor transformierte E. coli konnten bereits 3 Stunden nach Transformation mittels eines Zellsorters detektiert und in Kompartimente einer Mikrotiterplatte abgelegt werden, wo sie identisches Wachstums- und Expressionsverhalten zeigten. Für den Nachweis von Epoxidhydrolase-Aktivität wurde ein Assay auf Basis von p-(4-Nitrobenzyl)-pyridin entwickelt. Der Test wurde im robotergestützten Hochdurchsatzscreening einer Streptomyceten-Stammsammlung validiert. Es gelang damit allerdings nicht in einer durch rationale und Zufallsmutagenese erzeugten Proteinbibliothek einer Lipase aus Bacillus thermocatenulatus Epoxidhydrolase-Aktivität nachzuweisen. Ebenfalls durch Zufallsmutagenese wurden neue Peptide für die Metallaffinitätschromatografie entwickelt. Ausgehend von einer bekannten Metallbindungsstelle einer ATPase aus Helicobacter pylori wurde das Sequenzmotiv HxHxxxCxxC mittels wobble Primer Technik variiert und an das gfp fusioniert. Die so entstandene Proteinbibliothek wurde mittels eines Laborroboters in Mikrotiterplatten auf die Bindungseigenschaften an Metallaffinitätsmatrizen untersucht. Es wurden Affinitätspeptide mit gegenüber dem (His)6-Tag deutlich verbesserten Eigenschaften gefunden. Die breite Anwendbarkeit des Affinitätspeptids konnte am Beispiel der Aufreinigung einer Lipase aus Bacillus thermocatenulatus, die sowohl in E. coli als auch in Streptomyces lividans exprimiert wurde, gezeigt werden.
Open Access
Erstellung einer Enzymbibliothek über gerichtete Evolution, Entwicklung von Assaysystemen zur Durchmusterung von Enzymbibliotheken auf Epoxidhydrolaseaktivität, Aufreinigung einer Epoxidhydrolase aus Streptomyces antibioticus
(1999) Zocher, Frank; Schmid, Rolf (Prof. Dr.)
Im Rahmen dieser Arbeit wurde versucht durch Methoden der zielgerichteten Mutagenese und der gerichteten Evolution aus einer Esterase aus Pseudomonas fluorescens und einer Lipase aus Bacillus thermocatenulatus eine Enzymvariante mit Epoxidhydrolaseaktivität zu erhalten. Um die katalytische Traide der Epoxidhydrolasen nachzuahmen wurde in beiden Enzymen das Serin im aktiven Zentrum gegen Asparaginsäure ausgetauscht und Mutationen über error-prone PCR eingeführt. Die Varianten wurden vereinzelt, die Bakterien in Mikrotiterplatten kultiviert und die Enzymvarianten exprimiert. Hierzu war die Entwicklung eines Assay notwendig. Als Assaysubstanzen fanden mit Chromophoren substituierte Epoxycarbonsäureester Verwendung. Dabei konnte bei diesen Varianten keine Epoxidhydrolaseaktivität nachgewiesen werden. Zum direkten Nachweis der Epoxidhydrolyse wurde ein Assay basierend auf der Reaktion von 4-(4´-Nitrobenyl)-pyridin mit einem Epoxid in Mikrotiterplatte entwickelt. Durch den Einsatz eines Lösungsvermittlers und Optimierung der Reaktionsbedingungen konnte die Epoxidhydrolyse in Gegenwart von ganzen Mikroorganismen oder Rohextrakt nachgewiesen werden. Dabei konnten in den erzeugten Enzymbibliotheken keine Epoxidhydrolase gefunden werden, allerdings konnte innerhalb der Gattung der Streptomyceten Epoxidhydrolasen identifiziert werden. Der Stamm mit der höchsten Epoxidhydrolaseaktivität (S. antibioticus Tü4) wurde fermentiert und die Epoxidhydrolase teilweise aufgereinigt. Verschiedene Epoxide (Styroloxid, 1,2-Decanoxid und 2,3-Epoxy-3-phenyl-propionsäureethylester) wurden ganzen Zellen oder der angereinigten Epoxidhydrolase umgesetzt und die Umsetzungen gaschromatographisch verfolgt. Die Stabilität der Epoxidhydrolase in Gegenwart verschiedener Cosolventien wurde untersucht. Der Stamm zeigte eine hohe Aktivität gegenüber 2,3-Epoxy-3-phenyl-propionsäureethylester und eine moderate Enantioselektivität (E=13) bei der Racematspaltung von Styroloxid.
Open Access
Lipase-katalysierte Synthese strukturierter Triglyceride: Verfahrensoptimierung und Erzeugung selektiver Lipasemutanten durch gerichtete Evolution
(1999) Schmid, Ulrike; Schmid, Rolf (Prof. Dr.)
In der vorliegenden Arbeit wurde zum einen die Lipase-Katalysierte Synthese strukturierter Triglyceride, zum anderen die Veränderung der Kettenlängenselektivität der slip1-Lipase aus C. rugosa durch gerichtete Evolution untersucht. Besonderes Interesse galt der Synthese von strukturierten Triglyceriden des ABA-Typs, die aufgrund ihrer symmetrischen Struktur zur Therapie von Fettabsorptionsproblemen wie z.B. Pankreasinsuffizienz eingesetzt werden können. Besonderes Interesse galt dabei der Synthese von 1,3-Dioleoyl-2-palmitoylglycerin (OPO), das in Säuglingsnahrung als Fettkomponente eingesetzt wird. Durch die Entwicklung eines Zweischrittverfahrens unter Berücksichtigung lebensmittelrechtlicher Aspekte gelang es, ABA-Triglyceride unter Verwendung von 1,3-regiospezifischen Lipasen in hoher Ausbeute und Reinheit zu synthetisieren. Die Zweischrittsynthese gliedert sich in eine Alkoholyse als ersten Reaktionsschritt, gefolgt von einer Veresterung im zweiten Reaktionsschritt. Das Zielprodukt der Alkoholyse, 2-MP, konnte durch Kristallisation sehr rein (> 95 %) mit einer Ausbeute von 82 % isoliert werden. Die regiospezifische Analyse mit Pankreaslipase ergab hochreines OPO mit 96 % Palmitinsäure in sn2-Position und 90 % Ölsäure in sn1(3)-Position. Im zweiten Teil der Arbeit wurde durch gerichtete Evolution die Kettenlängenselektivität einer synthetischen Lipase aus Candida rugosa verändert. Mittels error prone PCR wurde das slip1-Gen mutiert und durch Transformation in Saccharomyces cerevisiae in vivo recombiniert. Zur Identifizierung von gewünschten Mutanten wurde ein aus p-Nitrophenylestern unterschiedlicher Kettenlänge bestehender Assay entwickelt, wobei das durch Lipaseaktivität freigesetzte p-Nitrophenol bei 410 nm photometrisch detektiert wurde. Die selektierten sechs Klone wurden sequenziert und die Mutationen ausgewertet. Eine Mutante zeigte eine deutlich erhöhte Selektivität gegenüber Palmitinsäure und Stearinsäure im Vergleich zum Wildtyp.
Open Access
Massenspektrometrische Diagnostik von CYP2B6 Polymorphismen : phänotypische Ausprägung in Lebergewebe und klinische Bedeutung
(2008) Blievernicht, Julia; Schmid, Rolf (Prof. Dr.)
Für Fremdstoff- und Arzneimittelstoffwechsel sind hauptsächlich die Cytochrom P450 (CYP) Enzyme der Leber verantwortlich. Diese Superfamilie der Monooxygenasen ist fähig, Arzneimittel und andere potentiell toxische Fremdstoffe in hydrophilere und damit leichter eliminierbare Stoffwechselprodukte umzuwandeln. Das CYP Isoenzym CYP2B6, das im Zentrum dieser Arbeit steht, metabolisiert verschiedene klinisch verwendete Medikamente wie Cyclophosphamid (ein Zytostatikum), Bupropion (Raucherentwöhnungstherapie) oder den reversen Transkriptase Hemmer Efavirenz (HIV-Therapie). Expression und Aktivität dieses Enzyms sind interindividuell hochvariabel, was neben biologischen und Umwelt-Faktoren auch genetische Ursachen hat. Zu Beginn dieser Arbeit waren Ausmaß und Auswirkungen von „single nucleotide polymorphisms“ (SNPs) bislang nur unzureichend untersucht. Dies lag hauptsächlich daran, dass ein geeignetes analytisches Verfahren für die Detektion der immer größeren Zahl von neu entdeckten Varianten und deren phänotypische Korrelation fehlte. Die MALDI-TOF Massenspektrometrie ist ein effizientes und sensitives Hochdurchsatz-Verfahren zur gleichzeitigen Detektion mehrerer SNPs. Der Vorteil gegenüber anderen Verfahren beruht auf der simultanen Genotypisierung mit Hilfe allel-spezifischer Primer-Verlängerungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde auf dieser Basis eine hocheffiziente Genotypisierungsmethode entwickelt, validiert und etabliert. Die Methode ermöglichte es, für große Probenzahlen viele Mutationen (n=19) des CYP2B6 Gens in kurzer Zeit und mit großer Präzision zu detektieren, wie an einem ausführlichen Vergleichstest nachgewiesen wurde. Der zweite Teil der Arbeit konzentrierte sich auf die Untersuchung der möglichen klinischen Relevanz einzelner CYP2B6 Polymorphismen und Allele durch veränderte Proteinexpression bzw. -aktivität, unter Berücksichtigung von nicht-genetischen Faktoren wie Geschlecht, Alter, Rauchverhalten, Kaffee- bzw. Grapefruitsaftgenuss und Medikation. Dies konnte anhand einer umfangreichen Leberbank (n=235) durchgeführt werden. Die Ergebnisse liefern erstmals deutliche Hinweise auf die Assoziation einiger Allele, hier sei das CYP2B6*6 Allel hervorgehoben, mit einem niedrigen Protein-Gehalt und einer erniedrigten Enzymaktivität. Eine signifikante Beeinflussung der Proteinexpression oder der Enzymaktivität durch das Geschlecht, das Alter oder die Umweltfaktoren konnte dagegen nicht nachgewiesen werden. Allerdings wurde ein Induktionseffekt der CYP2B6 Expression bei Patienten beobachtet, die mit dem Antiepileptikum Carbamazepin oder dem Analgetikum Metamizol behandelt wurden. Verschiedene Kooperationen zu klinischen Gruppen ermöglichten die Untersuchung von Polymorphismen des CYP2B6 an Patientenkollektiven mit differentem Krankheitshintergrund. CYP2B6 und Morbus Parkinson: Neurologisch wirksame Substanzen wie Selegilin (Parkinson-Therapie) und andere exogene Umweltstoffe (Nikotin) werden von CYP2B6 metabolisiert. Das Protein ist zudem auch im Gehirn exprimiert. Eine mögliche Assoziation von CYP2B6 mit der Parkinsonschen Krankheit wurde mit Hilfe der Genotypisierung der CYP2B6 Polymorphismen an DNA-Proben einer „case-control“ Studie mit Parkinson Patienten untersucht, in der Polymorphismen in anderen Stoffwechsel-Enzymen als mögliche Risiko-Faktoren beschrieben wurden. Diese Analyse ergab jedoch keinen signifikanten Unterschied der Frequenz der CYP2B6 Genotypen zwischen Patienten und Kontrollgruppe. Dass CYP2B6 für die Entstehung von Morbus Parkinson eine Rolle spielt, kann damit jedoch nicht grundsätzlich ausgeschlossen werden. Denn möglicherweise wirkt sich der Polymorphismus nur in Zusammenhang mit bestimmten Noxen aus. Dies könnte in spezifischen Studien weiter untersucht werden. CYP2B6 und HIV-Therapie: Neue und seltene CYP2B6 Mutationen waren hinsichtlich ihrer funktionellen Bedeutung in der HIV-Therapie noch weitestgehend unbekannt. Die Ergebnisse der Genotypisierung von DNA-Proben verschiedener HIV-Populationen belegten eindrucksvoll die Assoziation der CYP2B6 Variante *6 sowohl mit erniedrigter Proteinexpression und Efavirenz-Hydroxylierung in vitro als auch im klinischen Umfeld der Efavirenz-Therapie. Zum ersten Mal wurde hier eine umfassende Analyse durchgeführt, die neben dem *6-Allel auch seltenere „loss-of-function“ Allele mit einschloss. Dadurch konnte die Prädiktivität für unerwartet hohe Plasmaspiegel des HIV-Therapeutikums erheblich gesteigert werden. Die technischen Entwicklungen und Erkenntnisse der vorliegenden Arbeit können zukünftig helfen, die Arzneimitteltherapie mit CYP2B6 Substraten zu optimieren. Sie unterstreichen den Wert der umfassenden prädiktiven CYP2B6 Genotypisierung für eine Anpassung der Medikamentendosis, um Nebenwirkungen zu vermeiden und das Ansprechen zu verbessern.
Open Access
Microarray and molecular genetic analysis of aberrant splicing in human drug metabolizing cytochromes P450 CYP2D6 and CYP2B6
(2008) Hofmann, Marco Hans; Schmid, Rolf (Prof. Dr.)
This study was devoted to the detection of alternative splicing within the Cytochrome P450 enzymes 2D6 and 2B6, mapping of the most common splice variants and to draw connections to certain single nucleotide polymorphisms (SNPs) and alleles. For both enzymes a splicing sensitive microarray was developed. The microarray was produced and optimized in all steps including the oligonucleotide probe design, microarray processing and target preparation, optimization of hybridization conditions and the development of a new data quantification method for the used probe design. For the developed splicing platform a design was chosen based on 5 different probes. Within the CYP2D6 gene it was known that the SNP 2988G>A (allele *41) in intron 6 shifts splicing towards a variant lacking exon 6, what explains the intermediate phenotype within allele *41. The splicing platform verified this splicing aberration in allele *41. Using the microarry specific splicing patterns were monitored in human liver tissue within the most common alleles of CYP2D6 *1, *2, *4 and *41. It could be observed that within mRNA from allele *41 carriers additionally to the known transcript variant, which is lacking exon 6, total or partial retention of intron 5 and 6 was enhanced. Transcript patterns of CYP2D6*1 and *2 were similar with 5 times higher amount of the full functional transcript (NP), including all nine exons, compared to allele *41. The splicing array showed to be a valuable tool not only for detection of splicing variants in human liver tissue but additionally for detection for allele specific splicing patterns. The existence of highly homologous Cytochrome P450 pseudogenes, which in some cases, as in CYP2D7 also express alternative splicing variants, results in a major problem of interpreting the data from splicing arrays. The developed splicing platform is the first existing array with which gene and pseudogene specific transcript patterns can be monitored individually. The microarray platform can be easily transferred to other genes as shown for the second gene CYP2B6. Alternative splicing in this gene was so far only reported descriptive. CYP2B6 is a polymorphic human drug metabolizing cytochrome P450 with clinical relevance for several drug substrates including cyclophosphamide, bupropion and efavirenz. The common allele CYP2B6*6 [c. 516G>T, Q172H and c.785A>G, K262R] has previously been associated with lower expression in human liver and with increased plasma levels of efavirenz in HIV patients, but the molecular mechanism has remained unclear. With the developed splicing array for CYP2B6 allele specific splicing patterns were observed comparing CYP2B6*6 and CYP2B6*1. This lead to the idea that alternative splicing might play an important role in allele *6. This was investigated in more detail using RNA originating from well-documented human liver tissue. Analysis of mRNA in this tissue demonstrated that additional unknown splicing variants exist (SV8, SV7, SV9). Investigations in human liver tissue using RT-PCR and sequencing showed that the most common transcript in CYP2B6*6 was not the normal transcript (NP) but an alternative splicing transcript lacking exons 4 to 6 (SV1). SV1 was tightly associated with the allele*6 and apparently also with the rare variant c.777C>A (CYP2B6*3). The observations lead to the assumptions that alternative splicing might explain the decreased function observed in allele CYP2B6*6. Further investigations in this direction were performed by cloning CYP2B6 minigene constructs including all nine exons and additional intronic regions. Minigenes carrying the single c.785A>G polymorphism or the rare c.777C>A variant resulted in normal and intermediate expression phenotypes, respectively. In conclusion, the mechanism of the common allele*6 involves predominantly a pretranslational mechanism resulting in decreased enzyme expression. Aberrant splicing is leading to reduce functional mRNA, protein and activity. These results establish the SNP c.516G>T, a nonsynonymous exonic mutation, as the causal sequence variation for severely decreased expression and function associated with CYP2B6*6. This work emphasizes the role of SNPs in non-consensus splicing elements such as exonic and intronic splicing enhancers as well as the clinical relevance of alternative splicing in context of adverse drug reactions. In both investigated genes CYP2D6 as well as in CYP2B6 there exists a common allele (CYP2D6*41 and CYP2B6*6, respectively) in which aberrant splicing results in reduced amounts of functional transcript, reduced amount of protein and enzyme activity. The findings establishes the SNP c.516G>T as the causal sequence variation that can now be reliably used in pharmacogenetic studies in various clinical settings including prediction of drug plasma concentration, toxicity, drug effectiveness and dose adjustment.
Open Access
A model of the pressure dependence of the enantioselectivity of Candida rugosa lipase towards (±)-menthol
(2002) Kahlow, Ulrich; Schmid, Rolf (Prof. Dr.)
Transesterification of (±)-menthol using propionic acid anhydride and Candida rugosa lipase was performed in chloroform and water at different pressures 1,10,50,and 100 bar) to study the pressure dependence of enantioselectivity E. As a result,E significantly decreased with increasing pressure from E = 55 (1 bar) to E = 47 (10 bar), E = 37 (50 bar), and E = 9 (100 bar). To rationalize the experimental findings, molecular dynamics simulations of Candida rugosa lipase were carried out. Analyzing the lipase geometry at 1,10, 50,and 100 bar revealed a cavity in the Candida rugosa lipase. The cavity leads from a position on the surface distinct from the substrate binding site to the core towards the active site,and is limited by F415 and the catalytic H449. In the crystal structure of the Candida rugosa lipase,this cavity is filled with six water molecules. The number of water molecules in this cavity gradually increased with increasing pressure:six molecules in the simulation at 1 bar,10 molecules at 10 bar,12 molecules at 50 bar,and 13 molecules at 100 bar. Likewise,the volume of the cavity progressively increased from about 1864 Å 3 in the simulation at 1 bar to 2529 Å 3 at 10 bar,2526 Å 3 at 50 bar,and 2617 Å 3 at 100 bar. At 100 bar,one water molecule slipped between F415 and H449, displacing the catalytic histidine side chain and thus opening the cavity to form a continuous water channel. The rotation of the side chain leads to a decreased distance between the H449-N and the (+)-menthyl-oxygen (nonpreferred enantiomer) in the acyl enzyme intermediate,a factor determining the enantioselectivity of the lipase. Although the geometry of the preferred enantiomer is similar in all simulations,the geometry of the nonpreferred enantiomer gets gradually more reactive. This observation correlates with the gradually decreasing enantioselectivity E.
Open Access
Untersuchungen zur selektiven enzymatischen Hydroxylierung von Fettsäuren
(2008) Dietrich, Matthias; Schmid, Rolf (Prof. Dr.)
Ziel der vorgelegten Arbeit war die Untersuchung der enzymatischen Oxidation von Fettsäuren mit P450 Monooxygenasen. Dabei stand die Hydroxylierung von gesättigten Fettsäuren bzw. die Veränderung der Hydroxylierungsposition im Vordergrund. Cytochrom P450 Monooxygenasen (CYP) können molekularen Sauerstoff unter Aufnahme von zwei Elektronen aktivieren, wodurch ein Sauerstoffatom auf ein Substrat-Molekül übertragen wird, das andere Sauerstoffatom tritt bei der Reaktion in Form von Wasser aus. Die Elektronen für die Katalyse stammen von Cofaktoren (meist NADH oder NADPH) und werden mittels Elektronentransferproteinen auf das Hämeisen von P450 Monooxygenasen übertragen. Im Gegensatz zu den meisten anderen P450-Enzymen sind die Enzyme der Subfamilien CYP102A und CYP152A nicht von Redoxproteinen abhängig. Bei CYP102A-Enzymen handelt es sich um Fusionsproteine, die aus einer Monooxygenase- und einer FAD/FMN-enthaltenden Reduktasedomäne bestehen. Die Elektronen werden vom Cofaktor NADPH auf die Reduktase übertragen. Der schnelle Elektronentransfer im CYP102A-System führt bei der Umsetzung mit natürlichen Substraten (mittel- und langkettige Fettsäuren) zu den höchsten für P450 Monooxygenasen gemessenen Umsatzraten (>1000 min-1). Bei CYP152A1 handelt es sich genau genommen um eine Peroxygenase, die Wasserstoffperoxid als Elektronen- und Sauerstoffquelle nutzt. Mit langsameren Raten ist jedoch auch eine Katalyse mit molekularem Sauerstoff unter Verwendung von Elektronentransferproteinen möglich. Die CYP102A-Enzyme und CYP152A1 unterscheiden sich in der Regioselektivität der katalysierten Hydroxylierung. Während CYP102A-Enzyme Fettsäuren in subterminalen Positionen (omega-1 bis omega-3) hydroxylieren, erfolgt durch CYP152A1 die Hydroxylierung in alpha- und beta-Position. Die Verschiebung der Hydroxylierung der Capryl-, Caprin- und Laurinsäure nach gamma- und delta-Position würde in Hydroxysäuren resultieren, die direkte Vorläufer von Lactonen darstellen. Lactone sind interessante Geruchs- und Aromastoffe mit fruchtigem Charakter (Pfirsich, Kokosnuss). Für CYP152A1 wurden mit Hilfe des rationalen Protein-Designs verschiedene Mutanten erstellt, die eine im Vergleich zum Wildtyp veränderte Fettsäurebindestelle enthalten. Allerdings erwies sich nur der CYP152A1-Wildtyp als aktiv. Die erstellten Mutanten ließen sich zum Teil exprimieren, waren jedoch für die Umsetzung von Fettsäuren nicht produktiv. CYP102A7 ließ sich erfolgreich exprimieren und konnte in dieser Arbeit charakterisiert werden. CYP102A7 hydroxyliert Fettsäuren hauptsächlich in omega-2-Position, daneben werden noch omega-1- und omega-3-Position hydroxyliert. Daher ist CYP102A7 nicht für die Entwicklung einer gamma- oder delta-Hydroxylase prädestiniert. In Gegenwart des polaren Lösungsvermittlers DMSO zeigt CYP102A7 hohe Aktivität. Die Stabilität gegenüber Lösungsvermittlern ist besonders interessant für die Entwicklung von Prozessen mit hydrophoben Substraten. Neben Fettsäuren akzeptiert CYP102A7 auch Terpenoide als Substrate. Es wurden bereits zahlreiche Untersuchungen an CYP102A1 (P450 BM3) durchgeführt. Verschiedene Kristallstrukturen (mit und ohne Substrat komplexiert) machen das Enzym zugänglich für Methoden des rationalen Protein-Designs. Um die Regioselektivität der Fettsäurehydroxylierung von omega-1- bis omega-3-Position in Richtung gamma- und delta-Position zu verschieben, wurden Methoden der gerichteten Evolution und des rationalen Protein-Designs angewendet. Mit Hilfe eines in der Arbeit entwickelten Assays, mit dem über 6000 Mutanten analysiert wurden, war es nicht möglich eine wesentliche Verschiebung im Vergleich zum Ausgangsenzym zu erhalten. Allerdings wurden durch rationales Protein-Design Positionen identifiziert, die für eine zielgerichtete Veränderung des Produktmusters vorteilhaft sind. Mit der Mutante S72Y V78A F87A wurden, gemessen am Gesamtprodukt, 16% delta-, 5% gamma- und 9% beta-Hydroxylaurinsäure erzeugt.