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Die alpha-Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens: Verbesserung der Alkaliaktivität und Steigerung der spezifischen Aktivität mittels gerichteter Evolution
(2002) Bessler, Cornelius; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Amylasen werden häufig in Waschmitteln eingesetzt. Diese Anwendung werden Amylasen benötigt, die eine hohen Stabilität und Aktivität bei alkalischem pH besitzen. Zudem ist eine hohe spezifische Aktivität wünschenswert, da so Enzymmenge und dadurch Kosten gespart werden können. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung und Anwendung von Methoden der gerichteten Evolution auf die Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens (BAA) zur Steigerung der spezifischen Aktivität und der Alkaliaktivität. Die Gene für die BAA sowie zwei Punktmutanten derselben wurden durch Error-prone PCR mutagenisiert und durch Gen-Shuffling rekombiniert. Zur Durchmusterung der Mutantenbibliotheken wurde ein Hochdurchsatz-Test auf Basis des kommerziell erhältlichen Phadebas(r)-Tests entwickelt. Das pH-Optimum von Mutante 42 ist um eine pH-Einheit zu höheren pH-Werten verschoben und liegt bei pH 7. Dies führt zusammen mit einer um den Faktor fünf höheren Aktivität bei pH 10 zu einem verbreiterten pH-Profil. Außerdem stieg die Aktivität in den Periplasmafraktionen um den Faktor vier und die spezifische Aktivität um den Faktor 1,5 als beim Wildtyp. Eine weitere Mutante, Mutante 29 zeigt das pH-Profil des Wildtyps. Allerdings liegen Aktivität der Periplasmafraktionen und spezifische Aktivität um den Faktor 40 beziehungsweise um den Faktor 9 höher als beim Wildtyp. Mutante B1, die durch Error-prone PCR mit der Mutante 29 erzeugt wurde zeigt ebenfalls das pH-Profil des Wildtyps. Zudem ist ihre spezifische Aktivität niedriger als die der Mutante 29, aber immerhin noch um den Faktor 4,2 höher als die des Wildtyps. Durch Vergleich der Aminosäuresequenzen der Mutanten mit dem Wildtyp und mit homologen Amylasen konnte der Einfluss der einzelnen Mutationen erklärt werden.
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Biochemische Nachweisverfahren auf der Basis genetischer Regulationselemente: vom Reporterassay zum Repressor/DNA-Bindungstest
(2000) Köhler, Sabine; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
In der vorliegenden Arbeit wurde auf der Grundlage von genetischen Regulationselementen ein in vivo Assay und vergleichend hierzu ein in vitro Assay entwickelt. Ein rekombinanter E. coli Stamm wurde beim in vivo Reporterassay zur Detektion von 4-CBA verwendet, der bei Anwesenheit von 4-CBA Luziferase exprimiert. Durch Immobilisierung dieses Stammes konnte ein einfaches und spezifisches Testverfahren im Mikrotiterplattenformat entwickelt werden. Mit den optimierten Immobilisierungsbedingungen und der Verwendung einer Membranmutante von E. coli konnte ein Detektionslimit von 28 µM 4-CBA in 200 min erreicht werden. Zusätzlich wurde ein von den Eigenschaften der Zelle unabhängiges in vitro Assaysystem entwickelt. Da der Mechanismus der Tetrazyklinresistenz in Bakterien bekannt war, wurde Tetrazyklin als Analyt ausgewählt. Im neu zu entwickelnden Assay sollte der durch Tetrazyklin induzierte Abfall des Repressors von der Operator DNA zur quantitativen Bestimmung von Tetrazyklin benutzt werden. Dazu wurde der Tet Repressor mit N-terminal oder C-terminal fusioniertem Tag und nativ in E. coli überexprimiert. Die Funktionalität der Repressoren wurde im Gel-Mobility-Shift Assay untersucht. Nur der Repressor ohne Tag sowie der Repressor mit einem durch Proteaseverdau abgespaltenem Tag zeigten volle biologische Aktivität. Im Hinblick auf eine spätere Assay-Entwicklung wurde der Einfluß eines enzymatischen Markers auf die Repressor/Operator-DNA-Bindung mit derselben Methode getestet. Daraus folgte eine Versuchsdurchführung für den Mikrotiterplatten-Assay. Diese beeinhaltete die Immobilisierung des Repressors, die Bindung von Tetrazyklin an diesen und die Bindung POD markierter Operator-DNA an tetrazyklinfreie Repressoren. Die Bestimmung der POD Aktivität ließ Rückschlüsse auf die vorhandene Tetrazyklinkonzentration zu. Da dieses Assayformat mit sehr großen Standardabweichungen verbunden war, wurden markerfreie Oberflächenplasmonresonanzmessungen vorgenommen.
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Biokatalyse mit Cytochrom P450 Monooxygenasen: zur selektiven Oxidation von Terpenen und Fettsäuren
(2007) Budde, Michael; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Ziel dieser Arbeit war die selektive Oxyfunktionalisierung von alpha-Pinen sowie von hoch verzweigten Fettsäuren und Fettsäurederivaten zur Herstellung wertvoller Produkte und Synthesebausteine für die Riechstoff- und Pharmaindustrie. Die dabei verwendeten Biokatalysatoren CYP102A1 (P450 BM-3) aus Bacillus megaterium bzw. CYP102A2 und CYP102A3 aus Bacillus subtilis gehören zur Klasse der Cytochrom P450 Monooxygenasen. Diese sind in der Lage, molekularen Sauerstoff unter Aufnahme zweier Elektronen zu aktivieren und ein Sauerstoffatom auf das Substratmolekül zu übertragen, wobei das andere Sauerstoffatom in Form von Wasser freigesetzt wird. Die hier untersuchten Enzyme der CYP102A-Familie nehmen aufgrund ihrer Domänenarchitektur eine Sonderstellung unter den Monooxygenasen ein. Es handelt sich bei ihnen um Fusionsproteine, die eine FAD/FMN-enthaltenden Reduktasedomäne und eine Monooxygenasedomäne in einer Polypeptidkette enthalten, was einen effizienten Elektronentransfer gewährleistet und somit für die höchsten mit P450 Monooxygenasen gemessenen Umsatzraten sorgt (>1500 min-1 gegen unverzweigte Fettsäuren). Darüber hinaus sind sie nicht membrangebunden und somit wasserlöslich sowie stabil, was sie zu interessanten Kandidaten für die Etablierung biotechnologischer Prozesse macht. Hoch verzweigte Fettsäuren und Fettsäurederivate konnten mit Hilfe von CYP102A1 und der Dreifachmutante CYP102A1 A74G F87V L188Q regioselektiv hydroxyliert und somit zu Synthesebausteinen für die Produktion von Makrolidantibiotika umgesetzt werden, die dabei erzielten Umsatzraten erreichen die für unverzweigte Fettsäuren gemessenen Größenordnungen. Durch Aufnahme von Substratbindungsspektren konnte geklärt werden, dass – entgegen der Erwartung – hoch verzweigte Substrate das aktive Zentrum von CYP102A2 und A3 nicht erreichen. Die oben beschriebene Dreifachmutante war in der Lage, (-)-alpha-Pinen mit hoher Regioselektivität in Pinenepoxid umzuwandeln (72%, CYP102A1 A74G F87V L188Q), darüber hinaus ist es durch Anwendung von rationalem und datenbasiertem Proteindesign gelungen Mutanten herzustellen, die (-)-alpha-Pinen ebenfalls mit hoher Selektivität zu Verbenol umsetzen. Bei der Entwicklung der Mutanten kamen Methoden wie Einfachsättigungsmutagenese oder ortsgerichtete Mutagenese zum Einsatz, wobei auch im Rahmen einer Kooperation durchgeführte molekulardynamische Simulationen zur Verbesserung der Regioselektivität von CYP102A1-Mutanten bei der Oxidation von (-)-alpha-Pinen beigetragen haben. Um die durch Mehrfachsättigungsmutagenese erzeugten Mutanten im Hochdurchsatzverfahren durchmustern zu können, wurden die dafür notwendigen Arbeitsschritte optimiert und weitgehend automatisiert. Zudem konnte ein produktspezifischer, hochdurchsatzfähiger Test entwickelt werden, der auf einer Farbreaktion zwischen Verbenol und schwefelsaurer Vanillinlösung beruht und die quantitative Bestimmung von Verbenolkonzentrationen >1 mM in Mikrotiterplatten erlaubt. Nach Durchmusterung einer 5000 Klone umfassenden Mutantenbibliothek konnte schließlich die hochselektive CYP102A1 Y51V A74G F87V A111T L188S Fünffachmutante isoliert werden, die (-)-alpha-Pinen mit einer Umsatzrate von 218 min-1 zu 88% Verbenol hydroxyliert, was eine weitere Verbesserung der Aktivität der zuvor identifizierten CYP102A1 A74G F87A L188Q (83 min-1) Dreifachmutante bedeutete. Eine weitere Charakterisierung der (-)-alpha-Pinen oxidierenden Mutanten erfolgte in 10 ml Ansätzen unter Verwendung eines auf Formiatdehydrogenase basierendem Kofaktorregenerierungssystems, was den quantitativen Einsatz des teuren Kofaktors NADPH überflüssig machte. Außerdem sorgte die Verwendung einer organischen Phase für eine in situ Produktabtrennung, was die Stabilität der gebildeten Produkte unter Prozessbedingungen erhöhte. Die hier im 10 ml Maßstab erzielten Raum-Zeit-Ausbeuten (bis zu 450 mg l-1 h-1) übertreffen die bisher bekannten Verfahren zur mikrobiellen bzw. enzymkatalysierten Oxidation von alpha-Pinen um Größenordnungen.
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Biotransformation von 11-Desoxycortisol mit Schizosaccharomyces pombe und Aspergillus nidulans
(2005) Appel, Daniel; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
In diesem Projekt, welches in Kooperation mit dem Institut für Biochemie der Universität des Saarlandes und der Schering AG Bergkamen durchgeführt wurde, sollte mit Hilfe von rekombinanten Spalthefestämmen, welche die humane Monooxygenase P450 CYP11B1 exprimieren, eine nachhaltigere Bio-Produktion von Hydrocortison entwickelt werden, um das bestehende Verfahren der Hydrocortisonherstellung, mittels des filamentösen Pilz Curvularia lunata zu ersetzen. Um die Optimierung der Hydrocortisonproduktion im Fermenter zu verfolgen, wurde zunächst ein alternatives Nachweissystem für Hydrocortison entwickelt, welches eine schnellere semi-quantitative Bestimmung der Hydrocortisonmenge im Fermenter erlaubt. Der im ersten Teil dieser Arbeit entwickelte Assay basiert auf der Bildung eines Fluorophors bei Inkubation von Hydrocortison mit einer konzentrierten Schwefelsäure/Essigsäure-Mischung. Der so entwickelte Assay erlaubt eine direkte semi-quantitative Bestimmung des Hydrocortisons und dient dazu, die Veränderungen der Hydrocortison-Bildungsraten während der Fermentation zu Überwachen. Für die Bestimmung der exakten Hydrocortison-Mengen wurde eine bereits beschriebene HPLC-Methode verwendet. Die Optimierung der Fermentation wurde hauptsächlich mit den beiden rekombinanten S. pombe Stämmen CAD1 und CAD13 durchgeführt, welche die humane CYP11B1 Monooxygenase mitochondrial exprimieren. Beide Stämme wurden am Institut für Biochemie der Universität des Saarlandes entwickelt. Die ersten rekombinanten Stämme zeigten Umsatzraten von nur 3,1 μM*d-1. Diese Rate konnte für den CAD1-Stamm durch Fermentationsoptimierung auf 70,6 μM*d-1 erhöht werden. Durch Einbringen einer zusätzlichen Kopie des CYP11B1 auf einem autoso-mal replizierenden TOPO-Plasmid (CAD13-Stamm) ließ sich die Expressionsrate des P450 CYP11B1 und somit auch die Umsatzrate von Hydrocortison auf 168 µM*d-1 steigern. Durch die Optimierung der Fermentationsbedingungen bezüglich Umsatzrate und Biomasseproduktion wurde ein Fed-Batch-Prozess entwickelt, welcher eine gesteigerte Raum-Zeit-Ausbeute ermöglichte. Der im ersten Teil entwickelte Hydrocortison-Assay wurde zum Screening eingesetzt, um Stämme zu finden, welche in der Lage sind, eine Hydroxylierung von 11-Desoxycortisol an Position 11 des Steroidgrundgerüsts durchzuführen. Trotz der eigentlich unspezifischen Reaktion des Hydrocortison-Assays bilden nur Steroide mit einer Hydroxyl-Gruppe an Position 11 einen fluoreszierenden Farbstoff aus. Beim Screening einiger am Institut für Technische Biochemie vorhandenen Stämme konnte bei dem filamentösen Pilz Aspergillus nidulans eine hohe 11-Hydroxylierungs-Aktivität bei Verwendung von 11-Desoxycortisol als Substrat festgestellt werden. Die HPLC/MS- und 1H-NMR-Analyse zeigte die Bildung von epi-Hydrocortison (11alpha-Hydroxylierung), eines pharmakologisch unwirksamen Epimeren von Hydrocortison (11beta-Hydroxylierung). Durch die hohe Regioselektivität der gefundenen Reaktion wurde in weiteren Experimenten Progesteron als Substrat verwendet, welches in Säugetieren durch Hydroxylierung in 11alpha-Hydroxyprogesteron überführt wird. Nach Analyse mit 1H-NMR konnte gezeigt werden, dass Progesteron durch Aspergillus nidulans regioselektiv in 11alpha-Hydroxyprogesteron überführt wird. Es konnte in dieser Arbeit ein Steigerung der Hydrocortison-Bildungsrate durch Optimierung von diversen Fermentationsparametern von 3,1 µM*d-1 auf 168 µM*d-1 erreicht werden. Eine weitere Optimierung der verwendeten Stämme ist unbedingt erforderlich, da eine Nebenproduktbildung, wie die eines dehydrogenierten 11-Desoxycortisol-Derivats durch S. pombe, bei der Herstellung pharmakologischer Wirkstoffe nicht tolerierbar ist. Durch das entwickelte alternative Nachweisverfahren von Hydrocortison konnte ein filamentöser Pilz gefunden werden, welcher eine hohe 11-Hydroxylierungs-Aktivität gegenüber 11-Desoxycortisol und Progesteron zeigt, und die gebildeten Produkte durch NMR identifiziert werden. Die vollständige Sequenzierung des Genoms von Aspergillus nidulans erlaubt, die für die gefundene Aktivität verantwortlichen P450-Isoenzyme zu identifizieren und in andere Hefestämme wie Pichia pastoris zu klonieren.
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Cloning, expression, characterization and engineering of cytochrome P450 CYP116B3 from Rhodococcus ruber DSM 44319
(2007) Liu, Luo; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
The Cytochrome P450 monooxygenases are ubiquitous heme-containing proteins, which catalyze regio- and stereo-selective oxidations of non-activated hydrocarbon. Bacterial P450 enzymes are in most cases not membrane-associated, water soluble and exhibit relatively high stability. Several bacterial strains have been tested for their monooxygenase activity. During the in vivo screening, Rhodoccocus ruber DSM 44319 and Rhodococcus erythropolis DSM 43066 strains exhibited oxidation activity towards cyclohexane. Because the genome DNA sequence of the two Rhodococcus strains has not been sequenced, a homology search was applied using known P450 gene sequences from other Rhodococcus strains. A set of degenerate primers was designed to the most similar regions, identified through the DNA sequence alignment of P450RhF from Rhodococcus sp. NCIMB 9784 and P450 CYP116 from Rhodococcus sp. NI86/21. A P450-like gene fragment with 740 base pairs was amplified from Rhodococcus ruber DSM 44319 by PCR using these degenerate primers. The flanking regions of the P450-like DNA fragment were explored by directional genome walking using PCR combined TA-cloning. The entire P450 gene with 2313 bp was isolated. It encodes a protein of 771 amino acids. The primary protein structure suggests that it is a natural self-sufficient fusion protein consisting of a P450 monooxygenase domain, a flavin-containing reductase domain, and a [2Fe2S] ferredoxin domain. This new P450 gene from Rhodococcus ruber DSM 44319 was named by P450 nomenclature committee CYP116B3 and can be considered as a new member of class IV of cytochrome P450 monooxygenases. The cytochrome P450 monooxygenase CYP116B3 was successfully cloned into vector pET28a(+), and expressed in Escherichia coli BL21(DE3). Subsequently, the enzyme was purified using immobilized metal affinity chromatography with a total yield of 18.6 mg l-1 and purity of 85%. Thin layer chromatography detected only FMN within the reductase domain, as the sequence alignment had predicted. The reductase activity was determined using an exogenous electron acceptor cytochrome c. The reductase domain of this P450 CYP116B3 demonstrated a strong preference for NADPH over NADH. As well as P450RhF, P450 CYP116B3 catalyzed O-dealkylation of 7-ethoxycoumarin gave product 7-hydroxycoumarin. Furthermore, in the presence of NADPH, the P450 CYP116B3 demonstrated hydroxylation activity towards aromatic hydrocarbons, naphthalene, indene, acenaphthene, toluene, fluorene, m-xylene and ethyl benzene. The conversion of naphthalene, acenaphthene and fluorene resulted in respective ring monohydroxylated metabolites. Alkyl aromatics like toluene, m-xylene and ethyl benzene were hydroxylated exclusively at the side chains. The highest turnover rate catalyzed by wild-type P450 CYP116B3 is about 1 nmol of 7-ethoxyxoumarin converted per 1 nmol of P450 CYP116B3 per minute. Compare to P450 BM-3, the activity of P450 CYP116B3 is very low. In order to investigate the structure-function relationship, a structure model of P450 CYP116B3 was designed based on the known homologous structures. The position 109 was identified which is located on the ceiling of the substrate binding pocket. The substitution of alanine residue at position 109 by phenylalanine may promote binding and oxidation of smaller alkyl substrates, such as cyclohexane or alpha-pinene. However after the substitution no oxidation activity towards smaller substrates was detected. Only an increase of activity towards 7-ethoxycoumarin and PAHs was observed. Directed evolution provides a useful tool to explore enzyme functions without structural information. Therefore, directed evolution was carried out in this study to improve the enzyme activity. The mutagenesis was limited to the monooxygenase domain of CYP116B3. A mutation library was generated by error-prone PCR. A high throughput screening system was developed based on the O-dealkylation of 7-ethoxycoumarin using whole E. coli cells, which expressed the enzyme in 96-well microtiter plates. Finally, the two best mutants, 70A08 (A86T/T91S/A109F/I179F/I267L) and 74H10 (T91S/A109L/I179F/I267L) were identified after four error-prone PCR rounds with 100-fold increased O-dealkylation activity towards 7-ethoxycoumarin. To investigate the alteration of the substrate spectrum of the two mutants, a wide rang of potential substrates was tested, including known substrates of the wild-type CYP116B3. However, 70A08 and 74H10 did not show increased activity towards any substrate besides 7-ethoxycoumarin.
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Cloning, expression, purification and characterization of a novel cytochrome P450 isolated from Thermus thermophilus HB27
(2002) Blasco, Francesca; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Enzymes produced by extremophiles are of considerable biotechnological interest. They show activity and stability at extreme temperatures, low water activity and high hydrostatic pressure. The growing knowledge about "thermozymes" from thermophilic organisms obtained during the recent years and the importance of P450 monooxygenases as potential biocatalysts for industrial applications has created high interest in P450 enzymes from thermophilic bacteria and archaea. Although the homology between P450s is generally low, a few domains and sequence signatures are conserved and can be identified by homology searches. Following this approach a homology search of recently sequenced genomes from thermophiles was performed to identify novel P450 enzymes of this origin. Indeed, a region showing homology to a known bacterial P450 (P450 BM3 from Bacillus megaterium) was found within the Thermus thermophilus HB27 genome, currently being sequenced in Göttingen. Thermus thermophilus is a non-sporulating Gram-negative bacterium isolated from hot springs. Its genome of 1.82 Mbp (excluding the mega-plasmid pTT27 of 0.24 Mbp) has a GC-content of approximately 69 %. The optimal temperature for growth is between 65 and 72 °C, the maximum being 85 °C and the minimum being 47 °C. Bulk protein extracted from this thermophile is much more stable to heat than mesophilic protein extracts; and only about 10 % of the total protein is denatured by heating up to 110 °C for 5 min. Cytochrome P450 proteins, named for the absorption band at 450 nm of their carbon monoxide bound form, are a large superfamily of enzymes. P450s are ubiquitous enzymes essential for steroid biosynthesis, catabolism of drugs, utilization of carbon compounds as an energy source in bacteria, and in the production of various macrolide antibiotics. Sequence identity among P450s is often low (normally less than 20 %), but the structural fold has been conserved during evolution. P450s are heme thiolate proteins; the most conserved structural feature is a cysteine as fifth ligand to the heme iron. Normally P450s use electrons from NAD(P)H to catalyze activation of molecular oxygen, leading to regiospecific and stereospecific oxidative attack (often hydroxylation) of non-activated hydrocarbons at physiological temperatures. The substrates of P450s are extremely diverse. They are involved in the biosynthesis of hormones or antibiotics, as well as carcinogenesis and degradation of xenobiotics. The selective oxidation of an unactivated C-H bond in a complex organic molecule to the alcohol functionality (C-OH) has wide applications in chemical synthesis. The present work reports cloning, expression, purification, crystallization and characterization of CYP175A1, a cytochrome P450 from the thermophilic bacterium Thermus thermophilus HB27. For over expression the gene was amplified by PCR in the presence of specific primers from a DNA fragment kindly provided by Prof. H. J. Fritz (University of Göttingen). The PCR product was ligated into the polylinker region of pKK223-3 for expression under control of the tac promoter. The resulting clone was transformed in E. coli BL21(DE3)RP CodonPlus and selected for ampicillin and chloroamphenicol resistance. Expression was induced by IPTG and a yield of approx. 40 mg protein/liter culture was obtained. After cell disruption and ammonium sulfate precipitation P450_Tth was purified to homogeneity, following two different purification protocols. The fractions corresponding to the highest purity were used for crystallization, while the others were used for further biochemical characterization. The 44 kDa protein is soluble and displays an absorption spectrum in the reduced, oxidized, and carbonyl adduct analogous to those of other P450 enzymes. This enzyme exhibits thermostability with a melting temperature 30 °C higher than that of P450cam from P. putida. The crystal structure of CYP175A1 has been determined in co-operation with T. Poulos (University of California, Irvine). CYP175A1 exhibits the typical prism like P450-fold composed of 17 a-helices and 11 b-strands, corresponding to four beta sheets. The location of CYP175A1 in the T. thermophilus genome (close to crtB encoding a phytoene synthase), and the fact that genes for carotenoid biosynthesis occur as a cluster in T. thermophilus as well as in other carotenoid-producing strains, suggested that the gene may be involved in carotenoid biosynthesis. Heterologous complementation using Escherichia coli strains genetically enginereed to produce b-carotene indicated that CYP175A1 was able to catalyze the conversion of b-carotene to zeaxanthin via cryptoxanthin. The model of the b-carotene-CYP175A1 complex was generated. The hydrophobic nature of the ligand fitted well into the binding site of CYP175A1 which contained mostly hydrophobic or neutral residues. The position of the ligand in the active site of the enzyme showed that the C-3 of the b-ionone ring is the closest atom to the heme iron confirming the experimentally observed regioselectivity.
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CYP102A P450 monooxygenases: comparative analysis and construction of cytochrome P450 chimera
(2007) Eiben, Sabine; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
The members of the CYP102A subfamily are in several ways unique. They are natural fusion proteins of approximately 117-119 kDa comprised of the N terminal monooxygenase domain and a FAD and FMN containing diflavin reductase domain. These fatty acid hydroxylases exhibit extraordinary activities of 3000-10000 min-1 in comparison to other P450 monooxygenases making them promising candidates for industrial applications. Up to now, cloning and characterisation of only three members of this subfamily have been published: CYP102A1 from Bacillus megaterium and CYP102A2 and CYP102A3 from Bacillus subtilis strain 168. We have currently cloned and characterised another member of this family, CYP102A7, and there are at least eight more genes for CYP102A monooxygenases, which have been identified in several genome sequencing projects. Multiple sequence alignment of all amino acid sequences revealed that the similarity between different members is between 50 and 90 % according to which these enzymes can be divided into four groups. The four cloned enzymes belonging to three different groups but with 65 to 70 % similarity were used for further investigation. Despite their appearance to be similar, they often exhibit different properties. For example, the new isolated CYP102A7 catalyses the deethylation of 7-ethoxycoumarin which is not accepted as substrate by CYP102A1, CYP102A2 and CYP102A3. The hydroxylation patterns produced by these four monooxygenases are also different. Additionally we investigated solvent and thermal stability of these P450 monooxygenases. For example, the monooxygenase domain of CYP102A1 is much more stable than those of CYP102A2and CYP102A3. On the other hand, its reductase domain is less stable than the corresponding ones of CYP102A2 and CYP102A3. Therefore we exchanged the natural more unstable reductase domain of CYP102A1 with the more stable reductase domain of CYP102A3, using the natural linker of CYP102A1. The new chimera was able to hydroxylate substrates within a wider temperature range (up to 50°C) compared to the parental enzymes, showed higher process stability and has a half-life at 50°C more than ten times longer than CYP102A1. Further we substituted the reductase domain of CYP102A1 by a thermostable analogue. In the genome of the thermophilic Geobacillus stearothermophilus a gene was found exhibiting 50 % protein similarity to the reductase domain of CYP102A1. The gene encodes a hypothetical alpha-subunit of a sulfite reductase, but also belongs to the diflavin reductases. This reductase was cloned downstream of the monooxygenase domain of CYP102A1. Activity of the foreign reductase within the chimera A1GR was confirmed by cytochrome c reduction. Next to the ability to transfer electrons to the heme iron, oxidation of C14-C18 fatty acids was proven. While the hydroxylation activity of CYP102A1 towards myristic and palmitic acid decreased to about 5 % of the initial rate after incubation at 49°C, the chimera exhibited no loss of activity under the same conditions.
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Design and application of a DNA microarray for the identification of intestinal pathogens during gastroenteritis and monitoring of the resident intestinal microbiota
(2012) Hänel, Kristina; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Bacterial gastroenteritis is a commonly occurring disorder with three to five billion cases of acute diarrhea annually worldwide, particularly in developing countries where it is a leading cause of childhood morbidity and mortality. Diarrheal diseases can quickly reach epidemic dimensions, especially in the case of food-borne pathogens. Fast identification of the etiologic agent remains a key task in clinical diagnosis. Currently, it is mainly based on phenotypic classification using stool culture and a set of morphological, physiological, and serological tests. However, cultivation of the intestinal pathogen can often be a challenging and time-consuming task. Microarrays can fulfil the need for a rapid diagnostic tool that generates reliable information with a minimum of laboratory effort and do not rely on cultivation of the organisms. Here, a diagnostic oligonucleotide microarray was developed to detect the most common bacterial species associated with gastroenteritis. As a new concept, the array aimed at also providing information about the residential flora and potential probiotics. This combination allows not only pathogen identification but also a monitoring of the patients gut flora recovery during therapy. The developed array comprised probes for 23 species and 11 genera following a multiple-probe concept. This covers also 13 common bacterial gastroenteritis-related pathogens. The DNA array performance was initially verified with pure cultures from clinical isolates and DSM strains and confirmed by sequencing. The final array allowed unambiguous identification of the target species by combining the multiple-probe concept with a robust cut-off. The limit of detection was determined to be 103 genome equivalents. The clinical applicability was examined by processing stool samples from 58 patients with gastroenteritic symptoms and 6 healthy individuals using the diagnostic microarray. For 30 samples where the etiologic pathogen had been detected by a combination of culture and specific real-time PCR assays, 67% of these samples were correctly identified. It was assumed that a higher recovery rate would require a lower detection limit of the array. Furthermore, highly individualized communities of the detected resident bacteria were found in the analysed samples. A difference of this microbiota between healthy and infected subjects was not observed by multivariate analysis of the array data. This was attributed to the inhomogeneous sample group in terms of patient age and clinical diagnose. Additionally, the array was applied to investigate the influence of a viral, intestinal infection on the composition of the infantile microbiota and the establishment of human and porcine intestinal community in inoculated piglets. In both trials, also bacterial pathogens could be identified. Multivariate analysis of the microarray data revealed a significant difference of the resident flora between healthy and infected children and between the pig and human intestinal flora. Partial least squares analysis and one-way analysis of variance allowed identification of resident species or genera, which significantly differed between these groups. According to literature survey, this was the first application of principle component and partial least squares analysis for statistical evaluation of identification microarray data. The results indicated the applicability of the present microarray for studying the resident microbiota under a certain question. Nevertheless, it was concluded that more species should be included in the array to allow in-depth analysis of faecal microbiota. To address the problem of reliable quantification of intestinal bacteria and pathogens with a concentration range over several orders of magnitude using microarrays, a FRET-based system was developed. A black hole quencher was used to gradually quench the Cyanine 3 reporter signal allowing detection of a target species in the linear scanner range independent from its initial concentration. The proof of concept based on E. coli-specific probes showed that an effective quenching of the fluorophore label in the target was possible upon hybridization and dependent on the amount of immobilized quencher. It was concluded that two spots would be sufficient to detect 104 up to 2*106 genome equivalents in the linear range of the scanner. This setup partly overcomes the technical limitation of linear fluorescence signal acquisition for different amounts of bacteria. In summary, in this study solutions for two problems of molecular pathogen detection in the clinic were developed: (1) the time for pathogen detection and (2) the assay coverage. The analytical sensitivity for clinical application was not yet sufficient due to limitations of the pre-analytical procedures. A general concept to expand the linear range of a fluorescence intensity based detection system was achieved by a FRET-based system with immobilized quencher on the array surface.
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Development of a diagnostic microarray for the rapid detection of extended spectrum beta-lactamases for the use in clinical microbiology
(2005) Grimm, Verena Ulrike; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Among the most important types of resistances to be detected are the extended spectrum beta-lactamases (ESBLs). ESBLs are found in many different species of the family Enterobacteriacae. Most ESBLs are mutants of TEM- or SHV-type beta-lactamases. The TEM- and SHV- subtypes are derived from parental sequences (TEM-1, SHV-1) and differ from them by a variable number of amino acid substitutions. These mutations lead to an extended spectrum of activity against newer lactams, especially against 3rd generation cephalosporins. Other derivatives of the classical TEM or SHV enzymes also show an inhibitor resistant TEM (IRT) phenotype conferring resistance to beta-lactamase inhibitors. ESBL producing organisms are difficult to detect in standard phenotypic screening tests, mainly because of their widely varying levels of activity against various cephalosporins. For an improved accuracy confirmatory susceptibility tests have to be performed resulting in a response time of three days until the ESBL phenotype can be identified unequivocally. Since infections with ESBL producing organisms are registered with increased prevalence and are associated with significantly longer hospital stays and higher costs, more accurate tests to detect ESBLs in clinical isolates are necessary. The microarray technology allows the genotypic identification of resistance traits in less than one day of analysis time. Furthermore, the identification of the beta-lactamase variant on a molecular level will define for most ESBL isolates a specific substrate pattern, which can be considered for the determination of the appropriate antibiotic treatment. Additionally, the genotyping of resistances can be used for the reliable surveillance of multiresistant bacteria in wards or hospitals. In the present study a diagnostic microarray was developed for the rapid identification of mutations of the majority of the currently known TEM or SHV beta-lactamase variants, which are related to the ESBL and/or IRT phenotype. The assay enabled the detection and identification of 99 % of the relevant polymorphisms for TEM beta-lactamases and 100 % of the mutations of SHV beta-lactamases. This allows the detection of 96 % of the currently known TEM-variants and 100 % of the known SHV-variants. Consensus primers were developed and used for target amplification covering the majority of the known variant sequences. The sensitivity, reproducibility and identification capability of the developed arrays was determined with a set of reference samples. Furthermore, the TEM-array was validated by testing 72 clinical isolates collected in diverse institutions in Germany, Croatia and Russia. The SHV-array was validated by testing 30 clinical isolates collected in Croatia. The simultaneous detection of an extended spectrum-variant in presence of a narrow spectrum-variant was shown in a model system for TEM up to a ratio of 1:10, as well as in clinical isolates for SHV. Starting from the isolated DNA, the assay could be performed in less than 3.5 hours. The discrimination level, the sensitivity and the reproducibility were enhanced by automation of the hybridization procedure. The development of a marketable diagnostic ESBL microarray based on the presented prototypes and the extension of the developed system towards the detection of other relevant beta-lactamase families is in progress. In conclusion, the diagnostic test developed in this study offers a promising approach for the rapid identification and epidemiologic monitoring of TEM or SHV ESBL and IRT beta-lactamases.
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Development of disposable sensors for rapid multianalyte detection: acetylcholinesterase and microbial biosensors
(1999) Bachmann, Till T.; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Der Gegenstand dieser Arbeit war die Entwicklung von neuen Biosensoren zum simultanen Nachweis und der Klassifizierung von Stoffgemischen in der Umweltanalytik. Diese neuartigen Systeme sollten zur Detektion Acetylcholinesterase hemmender Insektizide aus der Gruppe der Organophosphate und Carbamate sowie halogenorganischer Stoffe eingesetzt werden. Diese Substanzen spielen insbesondere in der Überwachung der Wasserqualität eine entscheidende Rolle. Das Sensorprinzip basierte auf der Idee, biologische Rezeptorkomponenten, die unterschiedliche Spezifität für die Zielananlyten aufweisen, zu kombinieren, und deren Signalmuster durch künstliche neuronale Netze (KNN) auszuwerten. Alle entwickelten Systeme verwendeten durch Siebdruck hergestellte Dickschicht-Multielektroden als Sensorbasis. Zur Mustererkennung von Insektiziden wurden Biosensoren eingesetzt, welche Acetylcholinesterase-Varianten variierender Selektivität enthielten. Die Detektion halogenorganischer Verbindungen in Mischungen erfolgte mittels Sensoren, die mit Ralstonia eutropha JMP 134 Zellen bestückt waren. Die verschiedenen Selektivitäten dieser Sensoren wurden durch Kultivierung der Mikroorganismen auf unterschiedlichen Wachstumssubstraten erreicht.
Open Access
Diagnostische DNA-Microarrays zum Nachweis von Beta-Lactam-Resistenzen in der klinischen Mikrobiologie mittels Genotypisierung bakterieller Resistenzgene
(2009) Leinberger, Dirk Michael; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Eine der größten Resistenzproblematiken in der Humanmedizin ist die Unempfindlichkeit gramnegativer Infektionserreger, wie z. B. E. coli oder K. pneumoniae, gegenüber modernen Beta-Lactam-Antibiotika. Diese wird hauptsächlich durch die Produktion plasmidkodierter Beta Lactamasen mit erweitertem Wirkspektrum (ESBL) vermittelt. Als ESBLs wurden zunächst Varianten der TEM- und SHV-Enzyme bezeichnet, die aufgrund von Mutationen und den daraus folgenden Aminosäure-Substitutionen ein erweitertes Substratspektrum besitzen. Zusätzliche Varianten sind resistent gegenüber Beta Lactam-Inhibitoren (IRT) oder werden als komplexe Varianten (CMT) bezeichnet. Inzwischen besitzt die CTX-M-Enzymfamilie große klinische Relevanz und ist in Europa vorherrschend. Von wachsender Bedeutung sind ebenfalls plasmidkodierte AmpC-Beta Lactamasen und einige Beta-Lactamasen der Ambler Klasse D (OXA). Infektionserreger, die diese Enzyme produzieren, werden immer häufiger registriert und verursachen eine Vielzahl von Problemen bei der Therapie, Infektionskontrolle und Krankenhaushygiene. Die ESBL-Detektion ist zu einer klinischen Herausforderung geworden und klassische phänotypische Methoden werden den Anforderungen in diesem Bereich oft nicht gerecht. Ursächlich hierfür sind vor allem die heterogenen Substrataffinitäten der verschiedenen Enzyme. Die meist notwendigen Bestätigungstests verzögern das Testresultat und machen eine prospektive Therapie unmöglich. Da eine falsche empirische Therapie zu einem erhöhten Selektionsdruck, höheren Mortalitätsraten und Kosten führt, ist eine schnelle und eindeutige Information hinsichtlich der Resistenz eines Erregers essentiell. Molekulare Methoden haben ein großes Potential zur Beschleunigung der Erregerdiagnostik. Mit Hilfe der Microarray-Technologie können verschiedene Resistenzgene in weniger als einem Tag nachgewiesen und bis zur Identifikation der allelischen Variante genotypisiert werden. Anschließend können alle Informationen, die über das codierte Enzym zur Verfügung stehen, einschließlich des Substratspektrums, für die Therapieentscheidung und epidemiologische Fragestellungen genutzt werden. In dieser Arbeit wurde ein integrierter diagnostischer DNA-Microarray für den schnellen Nachweis und die Genotypisierung der in gramnegativen Bakterien häufigsten ESBL-assoziierten Resistenzgenfamilien, blaTEM, blaSHV und blaCTX-M, entwickelt und validiert. Der Microarray umfasst 618 spezifische Sonden, die in 2172 Spots angeordnet sind und zur Identifizierung von Mutationen dienen, die für 156 unterschiedliche Aminosäureaustausche verantwortlich sind. Daraus resultiert eine bisher unerreicht hohe Abdeckung bekannter TEM-, SHV- und CTX-M-Varianten. Nach umfangreichen Optimierungen in den Bereichen Sondendesign, Hybridisierungsbedingungen und der Etablierung einer effizienten Amplifikationsstrategie für die drei bla-Gene wurde der Chip mit 60 verblindeten klinischen Isolaten getestet, von denen 58 phänotypisch als ESBL-positiv charakterisiert wurden. Der Microarray-basierte Assay konnte die Genotypen der Isolate mit einer hervorragenden Diskriminierung und Reproduzierbarkeit auflösen, zeigte eine gute Genotyp-Phänotyp-Korrelation und eine robuste Identifikation von Mischungen von Varianten der gleichen Genfamilie. Die Daten der Studie wurden mittels Sequenzierung bestätigt. Die ESBL-Phänotypen konnten auf ESBL-Varianten von blaCTX-M (76 %), blaSHV (22 %) oder beiden (2 %) zurückgeführt werden. ESBL-Varianten von blaTEM wurden nicht nachgewiesen. Zwei Isolate, die aus unterschiedlichem Probenmaterial desselben Patienten stammten, enthielten jeweils zwei ESBL-Varianten von blaCTX-M (CTX-M-15 und CTX-M-14b). Die am häufigsten identifizierten ESBLs waren CTX M-15 (57 %) und SHV-12 (18 %). Aufgrund einer Dauer von 4,5 h und der hohen Abdeckung ESBL-assoziierter Gene und Genvarianten, könnte der hier entwickelte Assay eine interessante Option für den Resistenznachweis in der klinischen Mikrobiologie und die Überwachung der Verbreitung dieser Resistenzgene darstellen. Für die spätere Erweiterung des ESBL-Chips wurde ein Microarray für den Nachweis und die Identifikation von plasmidkodierten AmpC-Beta-Lactamasen entwickelt und erfolgreich mit Vertreten der C. freundii-Gruppe plasmidkodierter AmpCs getestet. Des Weiteren wurde die Validierung eines zuvor entwickelten OXA-Chips erfolgreich abgeschlossen. Diese Chips werden in Zukunft den klinischen Nutzen des Verfahrens noch einmal deutlich erhöhen.
Open Access
DNA microarray based gene expression profiling in human hepatocyte cells to serve as a basis for dynamic modelling of the human liver : a systems biology approach
(2008) Reichart, Thomas; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
This thesis provides a holistic overview over the gene expression pattern in human hepatocyte cells after induction with rifampicin. The expression levels of all human genes were determined using full genome microarrays from Affymetrix after several points in time (6, 24 and 72 h) after induction in three individual patients. In addition 151 liver specific genes were monitored more frequently using sub-genome Arrays from Eppendorf. The results were confirmed by Realtime PCR and Western-Blot analysis. Identified genes play a role in carbon metabolism (gluconeogenesis), in heme biosynthesis, in bulirubin-, bile acid- and lipid metabolism as well as xenobiotic-metabolism and transport. The observed cell response on RNA level over time allowed new insights in the regulation of this complex system. Next to the network reconstruction, based on the full genome array data, the highly time resolved measurements enable dynamic modelling of expression and therefore a mathematical reproduction of the cellular response upon the stimulus. Using the developed models predictions concerning the behaviour of the "system hepatocyte" and the associated regulations will be possible in the future. This model based prognosis will especially allow improved drug development and personalized medicine.
Open Access
DNA-Microarrays zur Identifizierung von pathoadaptiven Mutationen und Antibiotikaresistenzen in extraintestinal pathogenen Escherichia coli (ExPEC)
(2007) Barl, Timo; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Gegenstand dieser Arbeit war die Entwicklung von DNA-Microarrays zur Genotypisierung von E. coli für die klinische Diagnostik. Im ersten Teil der Dissertation wurde ein DNA-Microarray zur Detektion der häufigsten pathoadaptiven Mutationen in der Bindeuntereinheit von Typ 1-Fimbrien (FimH), die das Pathogenitätspotential von extraintestinal pathogenen Escherichia coli-Stämmen (ExPEC) erhöhen, entwickelt. Dieser Microarray wurde verwendet, um die fimH-Varianten von 131 E. coli-Isolaten zu genotypisieren. Sämtliche Ergebnisse wurden durch Sequenzierung bestätigt. Die insgesamt 16 nachgewiesenen verschiedenen Mutationen traten grundsätzlich in Kombination mit der dominanten Mutation V27A auf. Zusätzlich konnten für die hauptsächlich kommensalischen Gruppe A-Stämme die Mutation A202V bzw. für die pathogenen Gruppe B2-Stämme N70S, S78N und R166H als spezifische Marker identifiziert werden. In einem zweiten Teil wurde der vorbeschriebene gyrA-Microarray (Yu et al. 2004) zur Detektion der Fluorchinolonresistenz in E. coli überarbeitet und anschließend mit dem fimH-Microarray in einen Array integriert. Dabei wurden Mutationen an den Aminosäure-Positionen 83 und 87 berücksichtigt, die den ersten Schritt einer stufenweisen Akkumulation von Mechanismen darstellen, die zu einer klinisch relevanten Resistenz führen. Mit dem integrierten Array zur simultanen Detektion der relevanten Mutationen in fimH und gyrA wurden 141 Isolate genotypisiert. Dabei wurde in insgesamt 30 Isolaten mindestens eine resistenzauslösende Mutation nachgewiesen. Bei allen betroffenen Isolaten handelte es sich dabei ausnahmslos um Isolate aus Harnwegsinfektionen. Unter anderem konnte die phänotypische Chinolonresistenz von sechs klinischen Isolaten jeweils auf eine gyrA-Doppelmutation zurückgeführt werden. Zusätzlich wurde gyrA 255C als eine weitere Gruppe A-spezifische Position identifiziert. Die in dieser Arbeit verwendete Technologie der allelspezifischen Hybridisierung erwies sich als äußerst robust und leistungsfähig. Allerdings ist ein grundsätzliches Merkmal der Methode, dass für die unterschiedlichen Sondensätze häufig verschiedene Diskriminierungen zwischen Perfect Match- und Mismatchsonden beobachtet werden. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde erstmalig gezeigt, dass der Einsatz einer mismatchspezifischen Endonuklease (Surveyor Nuclease) zu einer verbesserten Auflösung insbesondere für cytosinhaltige Fehlpaarungen bei einem Oligonukleotidarray führt. Abschließend betrachtet wurden in dieser Arbeit eine Reihe grundlegender Ergebnisse über die allelspezifische Hybridisierung gewonnen: (1) Stille Mutationen in der Ziel-DNA sowie die Einbaurate des Fluoreszenzfarbstoffs hatten einen signifikanten Einfluss auf die absolute Signalintensität, waren jedoch für die Diskriminierung der Varianten unerheblich. (2) Mit einem 22 min dauernden PCR-Programm konnte ausreichend Ziel-DNA amplifiziert werden, um eine eindeutige Genotypisierung durchzuführen. Dies reduzierte die Gesamtdauer des Assays auf dreieinhalb Stunden nach der DNA-Extraktion. (3) Für die Genotypisierung waren 1000 Genomäquivalente als Eingangsmaterial für die PCR ausreichend. (4) Schließlich wurde gezeigt, dass eine Mischpopulation aus zwei fimH-Genotypen bis zu einem 50fachen Überschuss der einen Variante aufgelöst werden konnte.
Open Access
DNA-Microarrays zur parallelen Detektion und Genotypisierung toxischer Cyanobakterien
(2009) Peter, Harald; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Diese Arbeit präsentiert die Entwicklung eines Oligonukleotid-Microarrays zur Detektion von Cyanobakterien und dessen Anwendung zur Untersuchung von über 200 Wasserproben aus Baikalsee und Bodensee. Des Weiteren wurde erstmalig die Anwendung von ROC-Analysen zur Optimierung von Genotypisierungs-Arrays vorgestellt. Basierend auf 16S rDNA-Sequenzen wurden Sonden zur parallelen Detektion von Bakterien, Cyanobakterien und der potentiell toxischen Gattungen Anabaena, Aphanizomenon, Microcystis, Nodularia, Planktothrix und Cylindrospermopsis entwickelt. Weitere Sonden wurden zur Detektion verschiedener Spezies der nicht toxischen Gattung Synechococcus entwickelt. Der DNA-Microarray ermöglichte zusätzlich eine Unterscheidung zwischen potentiell toxischen und nicht toxischen Spezies der Gattung Microcystis durch eine Detektion des mcyA-Gens. Beide Zielgene (16S rDNA und mcyA) wurden dafür mittels Duplex-PCR simultan amplifiziert und fluoreszenzmarkiert, wodurch eine parallele Detektion sowohl der Gattung und Spezies, als auch des Toxizitätspotentials möglich ist. Alle Sonden wurden mit Hilfe von 30 Referenzstämmen in 170 Hybridisierungen validiert, bevor der DNA-Microarray zur Untersuchung von Umweltproben eingesetzt wurde. Der Vergleich verschiedener DNA-Extraktionsverfahren und die anschließende Optimierung jedes einzelnen Arbeitsschrittes führten zu einem sehr robusten Detektionssystem. Zusätzlich wurden grundsätzliche Untersuchungen zur Optimierung von Oligonukleotidsonden für DNA-Microarrays durchgeführt. Neben einer hohen Spezifität konnte auch eine ausreichende Sensitivität erreicht werden. Die Nachweisgrenze für Synechococcus-Spezies lag bei 2000 Zellen/ml. Mischungsanalysen zeigten, dass selbst in einem hohen Hintergrund aus nicht-toxischen Cyanobakterien des Baikalsees (1,3 x 105 Zellen/ml), das Toxingen mcyA noch von knapp unter 6200 Zellen/ml Microcystis viridis detektiert werden konnte. Nicht-toxische Cyanobakterien der Gattung Synechococcus konnten in fast allen Umweltproben des Baikal- und Bodensees in 0-30 m Tiefe detektiert werden. In keiner der Wasserproben konnten toxische Cyanobakterien gefunden werden. Alle Ergebnisse konnten mit klassischen, mikrobiologischen Methoden durch die Projektpartner bestätigt werden. Um eine schnelle und übersichtliche Erfassung und Auswertung umfangreicher Arraydaten zu gewährleisten wurden zusätzlich zum ROC-Analyse-Modul weitere Auswertungs-Module entwickelt, wodurch eine signifikante Zeitersparnis erreicht werden konnte. Zusätzlich wurde ein transportables Protokoll etabliert, welches den Einsatz von DNA-Microarrays im Feldversuch ermöglicht. Es konnte erfolgreich an Bord eines Forschungsschiffes auf dem Baikalsee getestet werden. Das im Rahmen dieser Arbeit entwickelte System kann damit zur schnellen und robusten Detektion von potentiell toxischen und nicht-toxischen Cyanobakterien in Trinkwasserreservoirs eingesetzt werden.
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The effects of low nitrate levels on the freshwater cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803: construction of a bioreporter assay and molecular characterization by transcriptome and proteome analysis
(2003) Mbeunkui, Flaubert; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Since a few decades the so-called blue algal blooms came to public awareness and their occurrence was more frequently reported. These blooms stem from the mass proliferation of some cyanobacterial species and they occur both in the sea as well as in fresh water. The exact reasons for this phenomenon have not been finally clarified, but nutrient availability, limitation and excess, has a proven influence. Some bioavailability patterns of P, N, S and Fe strongly promote cyanobacterial proliferation. Due to the negative effects of these blooms, i.e. severe neuro- and hepato-toxin release, a deeper understanding, prediction and monitoring are desirable. It was the aim of this work to develop and use biotechnological tools to fulfill this requirement. In order to avoid the problems associated with water blooms and to understand the behavior of these microorganisms at low nutrient concentration, an assay as an early warning system for monitoring of water blooms formation at low nitrate concentration was developed; and the analysis of the physiological change at the level of the transcriptome and proteome was performed. Starting with a cyanobacterial reporter strain, Synechocystis sp. strain PCC 6803 harboring PnblA::luxAB-kmR in its genome, a luminescent reporter assay for the detection of nitrate bioavailability was constructed. In this construction, luxAB gene encoding the luciferase, from the luminescent bacterium Vibrio harveyi was fused with the kanamycin resistance gene (kmR), leading to a luxAB-kmR gene complex. This gene complex was then fused with the nblA1 gene of Synechocystis and inserted in its chromosomal DNA. This reporter strain was designated N1LuxKm. The expression of the luxAB gene was induced by nitrate deficiency and was quantified by the bioluminescence emission. By means of immobilization of N1LuxKm in microtiter plates, the sensor was storable for about one month and showed a dose-dependent luminescence signal in a concentration range of 4-100 µM nitrate after a sample incubation time of 10 h under continuous illumination (50 µE.m-2.s-1 of white light). Combined with ecological and physiological data this sensor could be used as an early warning system for water blooms. In order to further understand cellular processes resulting from nitrate starvation and their influence on cyanobacterial blooms, the proteome dynamics of Synechocystis sp. PCC 6803 was analyzed through 2D gel electrophoresis, MALDI-TOF/MS of trypsin-digested protein fragments and N-terminal amino acid sequencing. This simultaneous analysis of total gene expression at the level of protein represents one of the premiere strategies for studying biological systems and understanding the relationship between various expressed genes and gene products. This approach allowed the identification of four proteins which were up-regulated under nitrate starvation conditions, namely two isoforms of "the nitrogen regulatory protein P-II" encoded by glnB gene; "the carbon dioxide concentrating mechanism protein" and the plastocyanin encoded by ccmK and petE genes respectively. The information gained with proteomics was confirmed and extended by RNA expression analysis related to nitrate depletion using oligonucleotide sequences immobilized on microarrays. Total RNAs were reverse transcribed to fluorescent-labeled cDNAs, then hybridized to the immobilized probes. The difference in the abundance of the transcripts was recorded through the difference in the fluorescence emission. All the genes, which encoded the proteins, identified with proteomics were up-regulated. nblA gene used for the construction of the reporter strain and the ntcA gene (found in the literature to be induced under nitrate deficiency) were also up-regulated whereas those encoding some units of the phycobilisomes were constantly expressed.
Open Access
Entwicklung eines diagnostischen DNS-Mikroarrays zur Genotypisierung der Chinolon-Resistenz von Escherichia coli
(2004) Yu, Xiaolei; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Chinolone gehören zu den leistungsfähigsten Antibiotika in der Humanmedizin. Die Resistenz gegen Fluorochinolone hat sich wegen des weltweiten Einsatzes dieses Medikaments schnell erhöht. E. coli ist eine der am meisten betroffene Spezies. Obwohl E. coli von Natur aus gegen Fluorochinolone sensitiv ist, wurde das Auftreten von E. coli Stämmen mit verringerter Empfindlichkeit gegen Fluorochinolone häufig beobachtet, besonders im Urinaltrakt-Bereich. Das vermehrte Scheitern von Behandlungen mit Fluorochinolonen ist darauf zurückzuführen. Die therapeutische Verwendung der Chinolone ohne Rücksicht auf eine mögliche Resistenz des Infektionserregers kann zu einem Behandlungsausfall sowie zu einer Induktion neuer Resistenzen führen. Ein schneller und präziser diagnostischer Resistenztest ist daher in der klinischen Anwendung von großer Bedeutung. Bis jetzt benötigen die Standardmethoden zur Detektion von Antibiotika-Resistenzen mehr als einen Tag. Durch die Verwendung der Mikroarray-Technologie kann die Testzeit in Zukunft bis auf wenige Stunden reduziert werden. Darüber hinaus kann die Detektion auf dem molekularen Niveau für die Überwachung von Patienten mit Langzeit-Antibiotikabehandlung und für die Untersuchung der Mechanismen von Resistenzen nützlich sein. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein diagnostischer Mikroarray zur Detektion von Punktmutationen entwickelt. Dieses Mikroarray-System kann die am weitesten verbreiteten Resistenzgenotypen von E. coli identifizieren. Anhand der Analyse von Sequenzen aus öffentlichen Datenbanken sowie eigener Sequenzierungsdaten von klinischen Isolaten, wurden die Aminosäurepositionen 83 und 87 in der Untereinheit A der DNS-Gyrase (Gen gyrA) sowie die Aminosäurepositionen 80 und 84 in der Untereinheit A der Topoisomerase IV (Gen parC) als Mutationshotspots identifiziert. Die auf diese vier Positionen gerichteten Oligonukleotidsonden wurden so entworfen, dass sie sowohl die wichtigsten resistenzverursachenden Mutationen, als auch die assoziierten stillen Mutationen abdecken. Die Methode der Allel-spezifischen Hybridisierung wurde für den gyrA-Array und die Allel-spezifische primer extension für den parC-Array verwendet. Die Funktionsfähigkeit beider Arrays wurde mit 36 E. coli Isolaten aus vier unterschiedlichen Krankenhäusern in Deutschland validiert. Die Ergebnisse der Mikroarray-Analyse stimmten mit den Resultaten der direkten DNS-Sequenzierung und der phäntotpyischen Untersuchung überein. Um die Assayzeit zu reduzieren und die Sensitivität zu erhöhen, wurden die Markierungs-PCR und die Hybridisierung hinsichtlich dieser zwei Faktoren optimiert. Das optimierte Verfahren war in der Lage, die Resistenz von E. coli bis zu einer Konzentration von 100 CFU/ml (gyrA) bzw. 1000 CFU/ml (parC) nachzuweisen. Außerdem war die Identifikation von resistenten E. coli in Anwesenheit eines zehnfachen Überschusses an sensitivem E. coli möglich. Unter der Verwendung von Hybridisierungsstationen konnte die gesamte Testdauer auf 3.5 Stunden (gyrA) bzw. 4.5 Stunden (parC) reduziert werden. Nach der erfolgreichen Vereinigung des gyrA- und parC-Arrays konnten Mutationen in beiden Genen gleichzeitig nachgewiesen werden. Das in dieser Arbeit entwickelte diagnostische Verfahren zur Bestimmung der Chinolonresistenz in E. coli bietet somit einen vielversprechenden Ansatz zur Verbesserung der Diagnostik von Infektionskrankheiten des Urogenitaltrakts und wird zukünftig mit der Entwicklung eines kommerziellen Prototyps fortgesetzt.
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Entwicklung hochsensitiver Biosensoren für neurotoxische Insektizide in Lebensmitteln : enzymatische in-vitro Aktivierung von Phosphorthionaten mit der Monooxygenase P450-BM3 und Sensitivitätssteigerung durch Proteindesign von Acetylcholinesterase
(2003) Schulze, Holger; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines sensitiven AChE-Biosensors für den quantitativ summarischen Nachweis neurotoxischer Organophosphate und Carbamate in Lebensmitteln und Säuglingsnahrung. Für die Untersuchung von Lebensmittelproben musste ein Verfahren entwickelt werden, welches unspezifische Matrixeinflüsse verhindert. Dies gelang durch Eingliederung einer Elektrodenbehandlung mit dem Tensid Tween 20 in das Testprotokoll. Dieser Schritt reduzierte die Probenvorbehandlung auf ein Minimum und lieferte ausgezeichnete Wiederfindungsraten von durchschnittlich 85% in den getesteten Lebensmittelproben. Der Biosensortest wurde mit Realproben vom Chemischen und Veterinäruntersuchungsamt (CVUA) Stuttgart erfolgreich validiert. Die Anwendbarkeit konnte im Rahmen einer gemeinsamen Studie mit dem CVUA Stuttgart gezeigt werden, in der Babybrei-Proben aus vier Ländern untersucht wurden. Hierbei wurden drei Überschreitungen des EU-Grenzwertes für Säuglingsnahrung festgestellt. Für Phosphorthionate konnte eine neuartige Aktivierungsmethode entwickelt werden. Phosphorthionate stellen den Hauptanteil der als Insektizide eingesetzten Organophosphate dar, sind in ihrer ursprünglichen Form dem AChE-Hemmtest aber nicht zugänglich. Die Dreifachmutante F87V, L188Q, A74G war im Gegensatz zum Wildtyp Cytochrom P450 BM-3 in der Lage, die Oxidation von Phosphorthionaten in die korrespondierenden starken AChE-Inhibitoren zu katalysieren. Die Analyse der Reaktionsprodukte mittels GC-MS/MS ergab eine quasi quantitative Umsetzung von Parathion und Chlorpyrifos zu Paraoxon bzw. Chlorpyrifos-oxon. Der indirekte Nachweis der enzymatisch aktivierten Phosphorthionate über die AChE-Hemmwirkung lieferte eine Transformationseffizienz von 85% für Parathion und 99% für Chlorpyrifos. Dieses Verfahren wurde erfolgreich in Lebensmittelproben getestet. Dies bedeutet eine deutliche Steigerung des Analytspektrums von AChE-Biosensoren. Die Sensitivität des AChE-Biosensors konnte durch Protein-Design von Nippostrongylus brasiliensis AChE gesteigert werden. Es wurden zehn Einfachmutanten und eine Mutante mit zusätzlicher Insertion von 26 Aminosäuren mittels ortsspezifischer Mutagenese hergestellt und in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris exprimiert. Die Ausbeute des Wildtyps konnte durch optimierte Kultivierungsbedingungen in einem 5L Fermenter auf 0,6 g/L gesteigert werden. Dieser Wert liegt deutlich über allen bislang erreichten Expressionsraten rekombinanter AChEn. Die AChE-Mutanten wurden im Hinblick auf ihre Sensitivität gegenüber den 11 wichtigsten Organophosphaten und Carbamaten getestet. Die Mutation M301(288)A in der Acyltasche des aktiven Zentrums der AChE lieferte die insgesamt sensitivste Mutante. Gegenüber Omethoat ergab sich eine 108-fache Sensitivitätssteigerung. Die Sensitivität gegenüber Pirimiphos-methyl konnte ebenfalls um zwei Größenordungen gesteigert werden. Insgesamt konnte die Sensitivität gegen 10 von 11 getesteten Insektizide erhöht werden. Damit konnte das Ziel, Konzentrationen im Bereich des Pestizidgrenzwertes von Säuglingsnahrung von 10 µg/kg zu detektieren, für acht 8 der 11 getesteten Insektizide erreicht werden.
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Entwicklung und Evaluierung von Assaysystemen zur Identifizierung des Substratspektrums von Epoxidhydrolasen, Aufreinigung und Charakterisierung einer Epoxidhydrolase aus Rhodococcus ruber DSM44319
(2003) Doderer, Kai; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Das Ziel der Arbeit war die Suche nach neuen Epoxidhydrolasen (EC 3.3.2.3), die in rekombinanter Form als Biokatalysatoren verwendet werden können. Die Suche nach neuen Epoxidhydrolaseaktivitäten kann auf zwei Wegen erfolgen. Datenbanken, wie z. B. "GenBank", können auf DNA oder Protein Ebene durch Sequenzvergleiche mit Programmen, wie z. B. BLAST nach Sequenzen durchsucht werden, die bekannten Epoxidhydrolasen ähnlich sind. Im umgekehrten Fall kann eine unbekannte, aus einem Organismus isolierte Sequenz mit anderen verglichen werden und so die putative Funktion bestimmt werden. Im ersten Teil der Arbeit wurden drei putative Epoxidhydrolasen aus B. subtilis, C. glutamicum und M. charantia, die durch Sequenzvergleiche identifiziert wurden, untersucht. Durch die Analyse der Proteinsequenz kann nicht auf die Substratspezifität rückgeschlossen werden, deshalb musste die Funktionalität mit mehreren Epoxiden getestet werden. Dafür wurden zwei Produktnachweise in Mikrotiterplatten für vicinale Diole entwickelt. Der PSS (Periodatspaltung und Färbung mit Schiffschem Reagenz) und PSC (Periodatspaltung und Detektion mit Carboxyfluorescein) Assay. Mit dem PSS-Assay wurden die Produkte einer Periodatspaltung mit Pararosanilin in einer Farbreaktion nachgewiesen. Der PSS-Assay erlaubt den direkten Nachweis der 1,2-Diole in wässriger Lösung in Gegenwart von Zelllysaten. Der PSS-Test wurde mit vier Substrat/Produkt Kombinationen validiert. In allen Fällen konnte ein Diolgehalt von mindestens 5 µmol/ml sicher detektiert werden. Die Standardfehler lagen unter 8%. Mit dem PSC-Assay wurde das nach der Spaltung verbliebene Periodat mit Carboxyfluorescein nachgewiesen. Der PSC-Assay wurde mit sieben verschiedenen Epoxiden und ihren korrespondierenden 1,2-Diolen validiert und es konnten Standardfehler von unter 4 % und ein Detektionslimit von <1 µmol/ml bestimmt werden. Somit ist der PSC Test zum Variantenscreening geeignet. Mit diesen beiden Assaysystemen wurden die drei obengenannten, rekombinant in E. coli produzierten, Epoxidhydrolasen untersucht. Dabei konnte keine Epoxidhydrolaseaktivität gegen alle getesteten Epoxide nachgewiesen werden. L(+)-Weinsäure wird in einem Maßstab von 30000 t/a bei Preisen von 5 €/kg vorwiegend aus Rückständen der Weinerzeugung hergestellt. Die sich daraus ergebenden starken jahreszeitlichen Schwankungen machen eine von Naturstoff unabhängigen Zugang zu L(+)-Weinsäure attraktiv. R. ruber DSM44319 ist in der Lage cis-2,3-Oxirandicarbonsäure zu L(+)-Weinsäure zu hydrolysieren. Das für die Hydrolyse von cis-2,3-Oxirandicarbonsäure verantwortliche Enzym wurde aus R. ruber DSM44319 durch eine mehrstufige Aufreinigung mit einem Reinigungsfaktor von rund 450 isoliert. Das aufgereinigte Protein wurde charakterisiert und die Teile der Proteinsequenz bestimmt. Mit diesen Fragmenten konnte bei einer Datenbanksuche in den US Patenten eine Hydrolase aus R. rhodochrous LMPG-18079 gefunden werden, die dieselbe Reaktion katalysiert. Es konnte nachgewiesen werden, dass die patentierte Protein- und DNA-Sequenz aus R. rhodochrous LMPG-18079 und R. ruber DSM44319 identisch sind. Proteinsequenzvergleiche zwischen der R. ruber Sequenz mit bekannten Epoxidhydrolasen zeigten keine Ähnlichkeit. Jedoch zeigt diese Sequenz eine hohe Ähnlichkeit mit vielen Halogencarbonsäure Dehalogenasen. Damit konnte gezeigt werden, dass die Hydrolase aufgrund ihrer Proteinsequenz als Halogencarbonsäure Dehalogenase (EC 3.8.1.5) einzustufen ist, obwohl sie in ihrer Funktionalität einer Epoxidhydrolase entspricht.
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Enzymatic production of sugar fatty acid esters
(2001) Yan, Youchun; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Zuckerfettsäureester finden breite Anwendung als Detergentien und Emulgatoren. Der größte Teil der im Handel befindlichen Zuckerfettsäureestern wird derzeit über chemische Verfahren unter Verwendung alkalischer Katalysatoren hergestellt. Das Hauptproblem dieser Verfahren sind die hohen Energiekosten sowie die mangelnde Regioselektivität der Synthesereaktionen. In dieser Arbeit gelang es, ein neues effektives enzymatisches Verfahren zur Synthese von Zuckerfettsäureestern zu entwickeln. Es basiert auf der Umsetzung eines Zuckers (Glucose) mit einer Fettsäure (Kettenlänge C6-C18) mittels Lipase-Katalyse (optimal: Lipase aus Candida antarctica B immobilisiert an einem Träger aus Polypropylen) in Gegenwart geringer Mengen eines Lösungsmittels (optimal: Ethylmethylketon bzw. Mischung von Ethylmethylketon und Hexan). Lösungsmittel und Reaktionswasser bilden ein Azeotrop, welches aus dem Reaktionsmedium durch Distillation entfernt wird. Das Lösungsmittel wird durch Membran-Pervaporation wiedergewonnen, bevor es in das Reaktionsmedium zurückgeführt wird. Das Verfahren wurde hinsichtlich der Auswahl geeigneter Lösungsmittel, verschiedener Membranmaterialien, Substratverhältnis, Enzymmenge, Reaktionszeit, Temperatur und Lösungsmitteleinfluss mittels response surface methodology optimiert. In dieser Arbeit erwies sich der traditionelle Rührkessel in Verbindung mit einem Pervaporation-Membranmodul als geeigneter Bioreaktor. Mit diesem wurden Versuche im 200 g-Maßsstab durchgeführt und 79% Ausbeute on D-Glucoseestern der Stearinsäuren erzielt. Außerdem wurden ungewöhnliche Zuckerester wie z.B. Vitamin C-Fettsäureester, Salicin-Fettsäureester und Zimtsäure-Glucoseester, die für medizinische und pharmazeutische Anwendungen interessant sind, im beschriebenen System erfolgreich synthesiert.
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Enzymes for industrial acrylation : redesign of candida antarctica lipase B and characterization of a new cutinase from alternaria brassicicola
(2009) Liu, Danni; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Candida antarctica lipase B (CALB) (EC 3.1.1.3) is a serine hydrolase with an alpha/beta hydrolase fold. BASF have screened some well-known enzymes for transesterification of hydroxypropylcarbamate (hpc: 1hpc, 2hpc, 3hpc and 4hpc) with methyl acrylate. The results showed that the CALB had the highest activity among all the screened enzymes. However, the wild-type CALB does not catalyze full conversion in an acceptable time scale. For industrial purposes it was necessary to increase the activity of the wild-type enzyme. The S-enantiomer of the secondary alcohol was identified as the bottleneck for reaching full conversion. In order to improve the acrylation, the stereospecificity pocket was redesigned using predictions from molecular modeling. Positions 278, 104 and 47 were targeted and a library for two-site saturation mutagenesis at positions 104 and 278 was constructed. For library screening, CALB variants were expressed in Escherichia coli (E. coli). This expression system is more suitable for high-throughput requirements in terms of expression time and number of clones. However, Pichia pastoris (P. pastoris) X-33 was selected as an ideal expression host of CALB for the higher expression level of the recombinant gene. After expression in P. pastoris, CALB variants were characterized with respect to activity in tributyrin hydrolysis, hydroxypropylcarbamates acrylate (hpca) hydrolysis and stereoselectivity in hydrolysis of 1-phenylethyl propionate. With respect of acrylation of hpc with methyl acrylate, lyophilized and immobilized CALB were used as an almost water-free reaction system since the presence of water in reaction can disturb the conversion. Apart from the identification of appropriate mutants, a suitable carrier for the enzyme also plays an important role in the reaction. It was shown that CALB showed only activity towards the substrate after immobilization on hydrophobic carriers, e.g. on Accurel MP1000. Therefore, hydrophobic carriers Accurel MP1000 and Diaion HP20L were prepared for the following transesterification studies. The best mutants L278A, L278A/W104F, L278A/W104F/S47A showed an increased activity in hydrolysis and transesterification of more than 30%. While the wild-type showed only 73% conversion after 6 hours in the target reaction, 95% conversion was achieved by the mutant L278A. Besides this reaction general hydrolysis activity (tributyrin) of the new CALB variants was increased up to 8-fold, while stereoselectivity decreased by a factor of 75 in hydrolysis of 1-phenylethyl propionate. Thus the new biocatalysts can be used for efficient transformation of a wide range of racemic alcohols and esters. Cutinase (EC 3.1.1.74) is a serine hydrolase with an alpha/beta hydrolase fold and can catalyze the hydrolysis of cutin. A patented cutinase from Humicola insolens (H. insolens) (Hi_Cutinase) showed high activity for the transesterification of methyl acrylate and amino- or mercaptoalcohol. For economical industrial applications, our aim was to find a cutinase, which shows homology to the Hi_Cutinase and exhibits also activity for the acrylation of methyl acrylate with amino- or mercaptoalcohol, which was 6-mercaptohexanol in our work. From analysis of the alignment of cutinases and the deduced 3D conformational models, a cutinase (pCUTAB1) from A. brassicicola showed homology to the proprietary cutinase from Humicola insolens (Hi_cutinase) with a sequence identity of 61%. As far as we know, this is the first time that the cutinase pCUTAB1 was cloned into the pPICZaA and integrated into the genome of the methylotrophic yeast P. pastoris X-33. The cutinase was expressed and secreted using alpha-factor signal peptide from Saccharomyces cerevisiae under control of the methanol inducible promoter of the alcohol oxidase 1 gene (AOX1). After expression at flask level, the supernatant was concentrated by ultrafiltration with a 10 kDa cut off membrane and purified to apparent homogeneity with hydrophobic interaction chromatography in a single step under native conditions using HiTrap™ Phenyl FF. The purified recombinant pCUTAB1 showed both the glycosylated and the unglycosylated forms, with distinct molecular weight of 24 kDa and 20 kDa respectively. The latter one corresponds to the mass of the mature protein without of the potential signal peptide of pCUTAB1. The cutinase prefers relatively bulky glycerol esters to single chain aliphatic esters, and showed the highest activity towards tributyrin. The optimum temperature and pH of the recombinant pCUTAB1 was 40°C, and pH 7-10 respectively. For acrylation of 6-mercaptohexanol, the cutinase immobilized on Accurel MP1000 showed higher activity than the immobilized lipase CALB. 90% conversion after 3 h was reached using the cutinase pCUTAB1, while the lipase CALB reached this level of conversion only after 7 h.