Browsing by Author "Schmitt, Georg"

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Spektroskopische Charakterisierung der Rubber Oxygenase RoxA aus Xanthomonas sp. 35Y
(2012) Schmitt, Georg; Jendrossek, Dieter (Prof. Dr.)
Thema dieser Arbeit ist die Charakterisierung der "Rubber Oxygenase A" (RoxA), einer extrazellulären Di-Häm-Dioxygenase aus dem Gram-negativen Bakterium Xanthomonas sp. 35Y. RoxA katalysiert die oxidative Spaltung von Naturkautschuk (Poly(cis-1,4-isopren)) in Produkte mit Aldehyd- und Keto-Enden. Es wurde eine Charakterisierung des Enzyms durch UV-Vis- und EPR (Electron Paramagnetic Resonance)-Spektroskopie durchgeführt. Das EPR-Spektrum von RoxA "as isolated" weist konstante low-spin-Signale der His-His-koordinierten C-terminalen Hämgruppe und variable high- und low-spin-Signale der N-terminalen Hämgruppe mit nur einem His-Liganden auf. Ferner wurde erstmals das CD (Circular Dichroism)-Spektrum von RoxA beschrieben. Im Rahmen einer Inhibitor-Studie wurde eine Hemmung der RoxA-katalysierten Spaltungsreaktion durch Reduktions- und Oxidationsmittel, substratähnliche Substanzen und typische Hämliganden wie z. B. Imidazol festgestellt. Insgesamt erlaubten diese Untersuchungen auch eine kritische Einschätzung des Aktivitätstest-Verfahrens. Es wurde eine zweistufige chromatographische Reinigung von rekombinant homolog exprimiertem RoxA etabliert. Anhand unterschiedlicher {alpha}-Banden bei 549 nm bzw. 553 nm sind die Hämzentren im reduzierten Zustand zu unterscheiden. Übereinstimmend mit einer sukzessiven, bald aufeinander folgenden Reduktion der Hämgruppen, belegten Redoxtitrationen kaum unterscheidbare Häm-Redoxpotentiale bei –65 mV und etwa –145 mV. Die räumliche Struktur von RoxA, die in Kooperation mit der AG Einsle (Freiburg) in einer Auflösung von 1,8 Å erhalten wurde, zeigt das C-terminale Häm His-His-koordiniert, das N-terminale nur von einem His-Rest und einem "O"-Liganden an sechster Position. Auf dieser Grundlage konnte die spektroskopische Untersuchung das etwas höhere Redoxpotential und die {alpha}-Bande bei 549 nm dem N-terminalen Häm zuordnen und zeigen, dass dieses bereits in RoxA "as isolated" für die Bindung externer Hämliganden zugänglich ist. EPR-Spektren weisen auf die Lokalisierung von Poly(cis-1,4-isopren) in der nahen Umgebung, nicht aber direkt am Häm-Fe des gleichen Hämzentrums hin, und veranschaulichen eine erschwerte Hämliganden-Bindung bei Anwesenheit von Latex. Die RoxA-Struktur zeigt eine Ähnlichkeit zu bakteriellen Cytochrom c Peroxidasen (CCPs) und MauG-Proteinen in der Anordnung beider Hämgruppen, sowie einiger konservierter Aminosäuren in deren Umgebung. Dennoch weist die unpolare Umgebung des katalytischen Zentrums in RoxA einen klaren Unterschied zu diesen Enzymen auf. Aufgrund der fehlenden Peroxidase-Aktivität und Inhibierung durch H2O2, sowie beträchtlicher Unterschiede der Häm-Redoxpotentiale zu CCPs, widerlegen die Ergebnisse eindeutig, dass RoxA eine Funktion als Peroxidase erfüllt. Wichtige Erkenntnisse zu den Redox- und Spinzuständen der beiden Hämzentren in RoxA lieferten Versuchsansätze nach Reduktion und anschließender Reoxidation durch Luftsauerstoff im Vergleich zu anderen Oxidationsmitteln. Die Untersuchung des in Abwesenheit von Kautschuklatex exprimierten rekombinanten RoxA erlaubte Aussagen zum Grundzustand des Enzyms vor dem Kontakt mit dem Substrat. So unterstützen EPR-Spektren einen diamagnetischen, EPR-unsichtbaren Zustand des N-terminalen Hämzentrums in RoxA "as isolated". Damit zusammenhängend, entsprachen in Gegenwart von Oxidationsmitteln eintretende Veränderungen im optischen Spektrum solchen, die nach Entfernung von Sauerstoff eintraten. Die Annahme einer stabilen Fe(II)–O2<–>Fe(III)–O2•– -Koordination in RoxA "as isolated" bietet eine gemeinsame Erklärung für diese Phänomene. Diese Ergebnisse erlauben die Erstellung eines Rahmens für den katalytischen Mechanismus der Kautschukspaltung durch RoxA: Als Startpunkt der Spaltungsreaktion wird ein oxygenierter Grundzustand angenommen, dessen Stabilität darüber hinaus für ein c-Typ-Cytochrom sehr ungewöhnlich ist und an ein O2-Bindeprotein erinnert. Zudem verweisen die Ergebnisse auf den Ablauf der Kautschukspaltung allein am N-terminalen Hämzentrum, das eine Funktion zur Bindung und Aktivierung von O2 erfüllt. Für eine Beteiligung der C-terminalen Hämgruppe gibt es keine Hinweise. Auch zeigt die Struktur von reduziertem RoxA keine Konformationsänderung an. Das Kautschukpolymer könnte durch einen hydrophoben Kanal zum katalytischen Hämzentrum gelangen. RoxA ist bislang das einzige c-Typ-Cytochrom, von dem eine Dioxygenase-Aktivität beschrieben ist. In jüngerer Zeit wurden jedoch zum RoxA-Protein ähnliche Genprodukte in den Gram-negativen Haliangium ochraceum (Hoch_1661, Hoch_1441) und Myxococcus fulvus (LILAB_11505), sowie Ähnlichkeiten in der jeweiligen genomischen Umgebung gefunden. Deren Entdeckung regt die Diskussion über eine Entwicklung unterschiedlicher Kautschuk spaltender Enzyme in Gram-positiven (Lcp) und Gram-negativen Bakterien (RoxA), sowie die Existenz weiterer RoxA-Homologen in Xanthomonas sp. an.