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    Änderung der Substratspezifität von Transaldolasen
    (2010) Schneider, Sarah; Sprenger, G. A. (Prof. Dr.)
    Transaldolasen (EC 2.2.1.2) gehören zur Enzymklasse der Transferasen und katalysieren den reversiblen Transfer einer Dihydroxyacetoneinheit von einem Donor auf einen Akzeptor. Dabei entsteht eine neue C-C-Bindung mit einer 3S, 4R-Konfiguration. Transaldolasen sind weit verbreitete Enzyme des Pentosephosphat-Weges und kommen in Bacteria, Eukarya und Archaea vor. Transaldolasen verwenden u.a. D-Sedoheptulose-7-Phosphat als Donor und übertragen eine Dihydroxyacetoneinheit auf D-Glycerinaldehyd-3-Phosphat, dabei entstehen zwei neue Produkte D-Fructose-6-Phosphat und D-Erythrose-4-Phosphat. In der Biokatalyse sind C-C-Bindungen knüpfende Enzyme wie z. B. die Aldolasen, die Produkte mit bis zu zwei neuen Stereozentren bilden, gegenüber chemischen Synthesewegen von Vorteil. Im Gegensatz zu chemischen Synthesewegen sind Enzyme meist hoch chemo-, stereo-, regioselektiv und arbeiten unter milden Reaktionsbedingungen. Aldolasen sind meist streng donorspezifisch. Aldolasen, die DHAP (Dihydroxyacetonphosphat) als Donor verwenden, werden zur Synthese von z. B. 13C-markierten Zuckern, Desoxyzuckern, Fluorozuckern, Antibiotika, Geruch-/Geschmacksstoffen, Azazuckern und Iminocyclitolen eingesetzt. DHAP ist von Nachteil, weil es instabil, schwierig zu synthetisieren und teuer ist. Ein Enzym, das DHA (Dihydroxyaceton) als Donor verwendet, wäre von Vorteil. Die Fructose-6-Phosphat Aldolase (FSA) von E. coli verwendet u.a. DHA als Donor. Vorteile von FSA sind, dass es ein breites Substratspektrum besitzt und schnell über Hitzefällung anzureichern ist. Nachteile von FSA sind, dass Muteine bei einer Hitzefällung häufig denaturieren und die Expressionshöhe je nach Stamm starken Schwankungen unterliegt. Ein weiteres Enzym von E. coli ist die Transaldolase B (TalB) TalB bildet neue C-C-Bindungen, besitzt ein relativ breites Substratspektrum und eine hohe Stereospezifität, wird aber bislang in der Biokatalyse nicht eingesetzt. Bei TalB ist von Nachteil, dass das Enzym aus zwei Substraten nicht ein Produkt im Überschuss liefert, sondern zwei Produkte äquimolar. In der vorliegenden Arbeit sollte die Transaldolase B (TalB) von E. coli durch Mutagenese, so verändert werden, dass Muteine mit veränderter Substratspezifität entstehen. Der erste Schritt war das rekombinante His6-TalB so zu verändern, dass eine neue Enzymvariante mit DHA als Donor und D-Glycerinaldehyd-3-Phosphat (D-GAP) als Akzeptor D-Fructose-6-Phosphat (D-F6P) mit einer höheren spezifischen Aktivität bildet als der Wildtyp. Damit würde die neue TalB-Variante DHA als Substrat verwenden und wäre damit als Ausgangspunkt für biokatalytische Synthesen von Interesse. TalB wurde der FSA in einem strukturbasierten Sequenzvergleich gegenübergestellt. An insgesamt elf Aminosäurepositionen des aktiven Zentrums von TalB, in denen sich die beiden Enzyme unterscheiden, wurden diese Aminosäurereste durch Sättigungsmutagenese in die 19 anderen Aminosäuren ausgetauscht. Für jede der elf Positionen wurde eine Bank mit bis zu 19 verschiedenen Proteinvarianten gebildet, die auf eine Synthese von D-F6P aus DHA und D-GAP (als D,L-GAP angeboten), mit einem neu entwickelten Farbnachweis im Mikrotitermaßstab, untersucht wurden. Nur der Aminosäureaustausch von Phe nach Tyr an der Position 178 (TalBF178Y) führte zur gewünschten verbesserten Aktivität [Schneider et al. 2008, JBC 283, S. 30064-30072]. His6-TalBF178Y wurde mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie gereinigt (Reinheit: > 97%) und charakterisiert. Als Vergleich wurden die E. coli Enzyme His6-TalB und FSA verwendet. Für His6-TalBF178Y wurde eine verbleibende Transaldolaseaktivität mit einem Vmax-Wert für D-F6P von 14 ± 1 U/mg (~ 16% der TalB-Wildtypaktivität) in der Transferreaktion gemessen. Dagegen wurde eine 70fach verbesserte Aktivität in der D-F6P-Bildungsreaktion (7 ± 1 U/mg, gegenüber His6-TalB: ≤ 0,1 U/mg), mit DHA als Donor und D-GAP als Akzeptor, bestimmt. Darüber hinaus besitzt His6-TalBF178Y eine ähnliche katalytische Effizienz wie FSA (kcat/Km von FSA: 130 M-1 s-1, His6-TalBY: 150 M-1 s-1). Die Affinität für DHA von His6-TalBF178Y ist doppelt so hoch wie die von FSA (Km-Wert für DHA von FSA: 62 ± 7 mM, His6-TalBF178Y: 30 ± 4 mM). In der strukturell sehr ähnlichen humanen Transaldolase (TALDO1, hTal) führte der Austausch der konservierten Aminosäure Phe189, von Phe nach Tyr (hTalF189Y), ebenfalls zum Erwerb einer FSA-Aktivität. Bei der Kondensationsreaktion von DHA und D-GAP zu D-F6P wurde ein Vmax-Wert für DHA von 14 U/mg (hTal: < 0,1 U/mg) bestimmt. Die hTal-Varianten, hTal und hTalF189Y, wurden als GST-Fusionsproteine gereinigt, die GST-Tags wurden mittels Tev-Proteaseverdau entfernt. Wie die bakterielle Transaldolase lag sowohl die wildtypische hTal (berechnete molekulare Größe von hTal: 37,5 kDa) wie auch hTalF189Y als Dimer (77 ± 10 kDa durch Größenausschlusschromatographie bestimmt) vor. hTalF189Y besitzt eine Transaldolase-Aktivität mit einem Vmax-Wert für D-F6P von 12 ± 2 U/mg (hTal: 29 U/mg). Sowohl His6-TalBF178Y als auch hTalF189Y katalysieren neben der Kondensation von DHA und D-GAP zu D-F6P auch die Spaltungsreaktion von D-F6P in DHA und D-GAP (Vmax-Wert für D-F6P: His6-TalBF178Y: 0,36 ± 0,05 U/mg; hTalBF189Y: 0,32 ± 0,04 U/mg). Polyklonale Antikörper gegen TalB erkennen auch TalBF178Y, GST-hTal und GST-hTalF189Y. Der zweite Schritt bestand darin His6-TalBF178Y so zu verändern, dass eine neue Enzymvariante den Akzeptor D-Glycerinaldehyd (D-GA, als D,L-GA angeboten) mit einer höheren Affinität verwendet als His6-TalBF178Y (Km-Wert: > 120 mM). Die Kristallstruktur von His6-TalBF178Y wurde in Kooperation mit T. Sandalova und Prof. Schneider (Stockholm, Schweden) gelöst [Schneider et al. 2008, JBC 283, S. 30064-30072]. Im Kristall von His6-TalBF178Y wird ein Sulfation des Puffers von den Aminosäuren Arg181, Ser226 und Arg228 gebunden. Das Sulfation ist ähnlich zu der Phosphatgruppe der Substrate, die wahrscheinlich von den drei Aminosäurereste (Arg181, Ser226, Arg228) gebunden wird. Durch Sättigungsmutagenese wurden drei verschiedene Sättigungsmutagenesebanken (TalBF178YR181X, TalBF178YS226X, TalBF178YR228X) gebildet. Diese Banken wurden mit DHA und D,L-GA als Substrate auf die Synthese von D-Fructose (D-Fru) in einem neu entwickelten Farbnachweis im Mikrotitermaßstab untersucht. In einer dieser Banken (TalBF178YR181X) wurden Enzymvarianten gefunden, die mit 10 mM D,L-GA und DHA eine höhere Aktivität zeigen als TalBF178Y. Die beste Variante, His6-TalBF178YR181E, besitzt für D,L-GA und D-GA eine deutlich höherer Affinität mit Km-Werten von 24 mM bzw. 25 mM als His6-TalBF178Y (D,L-GA: > 120 mM; D-GA; 73 mM). Mit D-GAP als Akzeptor und DHA als Donor besitzt His6-TalBF178YR181E keine messbare Aktivität. His6-TalBF178YR181E zeigt eine verbleibende Transaldolaseaktivität von 1 U/mg (~ 1% der TalB-Wildtypaktivität). Die Kristallstruktur von His6-TalBF178YR181E wurde aufgeklärt (T. Sandalova und Prof. Schneider, Stockholm, Schweden). In der Kristallstruktur von His6-TalBF178YR181E befindet sich im aktiven Zentrum ein Sulfation des Puffers und wird vermutlich von Glu181 und Arg288 mit schwächerer Bindung als in His6-TalBF178Y gebunden. Vermutliche ist Glu181 nicht geladen oder es bindet das Hydrogensulfation. Die Bindungseigenschaften eines Enzyms können durch Inhibitoren näher charakterisiert werden. Als Inhibitor für His6-TalBF178Y und His6-TalB wurde D-Tagatose-6-Phosphat (D-T6P) getestet. D-T6P ist ein Stereoisomer von D-F6P mit 3S, 4S-Konfiguration. Durch Inkubation von His6-TalBF178Y und His6-TalB mit verschiedenen Konzentrationen D-T6P, wurde His6-TalBF178Y, nicht aber His6-TalB, irreversibel inhibiert. Als Inhibitor für FSA wurde D-GA getestet. Es wurde gezeigt, dass FSA durch D-GA reversibel, nicht-kompetitiv inhibiert wird. Die Inhibitorkonstanten von FSA für D-GA wurden der Kic von 1,63 mM und der Kiu von 35 µM bestimmt. Ein weiterer Schritt sollte dazu führen, dass eine neue His6-TalB-Variante mit veränderter Stereospezifität entsteht, die aus DHA und D,L-GAP nicht D-F6P (3S, 4R) bildet, sondern dessen Stereoisomer D-Tagatose-6-Phosphat (3S, 4S; D-T6P). Aufgrund der Struktur von TalB und einem Modell mit D-F6P wurden zwei Aminosäurereste, Phe178 und Ser226, ausgewählt, die eventuell zu einer Änderung der Aktivität führen könnten. Drei verschiedene Sättigungsmutagenesebanken (TalBF178X, TalBS226X, TalBF178YS226X) wurden auf eine Synthese von D-T6P aus DHA und D-GAP (als D,L-GAP angeboten) mit einem neu entwickelt photometrischen Nachweis im Mikrotitermaßstab untersucht. In keiner der drei Banken wurde bislang eine positive Variante gefunden. Durch fehlerhafte Polymerasekettenreaktion wurden zwei Banken, epTalB und epTalBF178Y, mit niedriger Mutationsfrequenz (~2,3 Nukleotidaustausche/kb) gebildet. Die beiden epBanken könnten auf eine Synthese von D-T6P überprüft werden. Bei dem Screening auf eine Synthese von D-T6P der Sättigungsmutagenesebanken (TalBF178X, TalBS226X, TalBF178YS226X) wurde eine hohe Anzahl falsch-positiver Klone gefunden, deswegen wurde davon abgesehen epTalB und epTalBF178Y mit diesem Screening zu untersuchen. Die Banken stehen nun für neue bereits getestete Selektions- und Screeningmethoden zur Verfügung. In zwei Runden Sättigungsmutagenese konnte TalB so verändert werden, dass erstens D-F6P von TalBF178Y mit einer katalytischen Effizienz gebildet wird wie von FSA (TalBF178Y) und zweitens dass eine Doppelmutante, TalBF178YR181E einen dreimal niedrigeren Km-Wert für D-Glycerinaldehyd besitzt als TalBF178Y. Es konnte auch gezeigt werden, dass die Aminosäurepositionen Phe178 und Ser226 nicht oder nicht allein an der Bildung von Produkten mit neuer Stereokonfiguration beteiligt sind.