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Biotechnological production of aromatic amines and aromatic alcohols by recombinant Escherichia coli strains
(2019) Mohammadi Nargesi, Behrouz; Sprenger, Georg A. (Prof. Dr.)
Aromatic amine (AA) are an important group of industrial chemicals which are widely used for technical and pharmaceutical applications and described as the building block of drugs (Bedair et al. 2006; Jobdevairakkam and Velladurai 2009; Sacco and Bientinesi 2016), antibiotics, plastics and aromatic polymers (Arora 2015; Masuo et al. 2016; Tsuge et al. 2016; Kawasaki et al. 2018). In addition, aromatic alcohols, as other valuable compounds, are widely used in manufacturers of perfumes, cosmetics, and foods, and pharmaceutical industry (Etschmann et al. 2002; Miró-Casas et al. 2003; Bai et al. 2014). Most of the AAs and aromatic alcohols are chemically synthesized from petroleum sources and considered as “unnatural”, which are inappropriate to make cosmetic, drugs or food ingredient, thereby natural microbial biosynthesis of these valuable compounds in E.coli would be an alternative approach. In the first part of this study, a de-novo biosynthesis pathway was established for high titer production of three aromatic amines, para-amino-L-phenylalanine (L-PAPA), para-amino-phenylethanol (PAPE) and para-amino-phenylacetic acid (4-APA) from glucose/glycerol via genetic modification of the shikimate pathway in recombinant E. coli (Mohammadi et al. 2018 and 2019). To generate a platform strain for L-PAPA production from shikimate pathway, the genes pabAB from Corynebacterium glutamicum (Kozak 2006), papB and papC from Streptomyces venezuelae (Blanc et al. 1997; He et al. 2001; Mehl et al. 2003) were heterologously overexpressed from plasmid in E. coli FUS4.7R (Gottlieb et al. 2014). Then, the metabolic flux was directed to PAPE and 4-APA production via overexpression of aro10 from Saccharomyces cerevisiae (Kneen et al. 2011; Vuralhan et al. 2003 and 2005) and both aro10 and feaB in E. coli FUS4BCR, respectively. The engineered E. coli strains were cultured in the shake-flasks with fed batch condition and investigated for L-PAPA, PAPE and 4-APA production by HPLC and LC-MS. In the simple shake flask experiments, the plasmid based strain produced L-PAPA as high as 0.534 ± 0.024 g l-1 from 5 ± 0.24 g l-1 glycerol. Also, introduction of aro10 and yahK in L-PAPA producing strain resulted in 0.526 ± 0.025 g l-1 PAPE. Furthermore, by introducing feaB into the PAPE- producing strain, 4-APA was obtained with a titer of 0.458 ± 0.014 g l-1. Last but not least, by further strain improvement and optimizing growth condition via glucose/glycerol feed strategy, an increasing titer of L-PAPA, PAPE and 4-APA approximately 5.5 ± 0.4 g l-1, 2.5 ± 0.15 g l-1 and 3.4 ± 0.3 g l-1 were obtained, respectively. In subsequent fed-batch cultivation with a final volume of 12.2 l and the carbon sources glycerol, a final L-PAPA-titer of 16.8 g l-1 was obtained. This equals a yield of 0.13 L-PAPA / glycerol (g g-1) and a space-time-yield of 0.22 g l-1 h-1 L-PAPA formation over the whole process. Furthermore, a de-novo biosynthesis pathway for the production of 2-Phenylethanol (2-PE)/tyrosol from glucose with genetically engineered E. coli strains without additional L-phenylalanine/ L-tyrosine as supplement was demonstrated. Starting from chorismate, which is the direct precursor of phenylpyruvate (PP)/ 4-Hydroxyphenylpyruvate (4-HPP), an artificial Ehrlich biosynthesis pathway was created (Etschmann et al. 2002) toward 2-PE or tyrosol. To generate a platform strain for production of 2-PE and tyrosol from shikimate pathway, the genes pheA or tyrA encoding proteins chorismate mutase/prephenate dehydratase or prephenate dehydrogenase (feedback resistance variant, Rüffer et al. 2004; Gottlieb et al. 2014), respectively, were cloned and subsequently overexpressed from plasmid in E. coli. In the next step, the metabolic flux was directed to 2-PE and tyrosol production via overexpression of aro10 encoding phenylpyruvate decarboxylase from S. cerevisiae. Furthermore, in order to enhance the flux toward downstream 2-PE/tyrosol pathway, the relevant genes of three rate limiting steps including aroF, aroB and aroL were subcloned and overexpressed from plasmid. Upon simple batch cultivation, these strains separately yielded 369 ± 25 mg l-1 2-PE and 437 ± 33 mg l-1 tyrosol from 4.5 ± 0.21 g l-1 glucose. Final titer in the shake flask was further improved through glucose fed-batch fermentation to 1.75 ± 0.12 g l-1 2-PE and 1.68 ± 0.19 g l-1 tyrosol. The subsequent significant enhancement of 2-PE/tyrosol production occurred through employing in situ product removal (ISPR) techniques including two-phase extraction by different organic compounds (Etschmann et al. 2002; Rüffer et al. 2004; Schügerl and Hubbuch 2005; Hu and Xu 2011; Chreptowicz et al. 2018). In subsequent glucose-limited fed-batch cultivation with a benchtop bioreactor system (0.75 l), a final 2-PE and tyrosol-titer of 3.1 g l-1 and 3.6 g l-1 reached with a yield and a space-time-yield of 0.07 g g-1 and 0.03 g l-1 h-1 for 2-PE and 0.08 g g-1 and 0.04 g l-1 h-1 for tyrosol, respectively. These works have successfully demonstrated the possibility of synthesizing of several invaluable fine chemicals in whole-cell system using plasmid based-E.coli strains. In addition, the titter and yield previously reported in the biosynthesis of aromatic amines (L-PAPA, PAPE or 4-APA) or even aromatic alcohols (2-PE or tyrosol) have been significantly improved in this study.
Open Access
Biotechnologische Darstellung und strukturelle Charakterisierung fucosylierter Oligosaccharide
(2016) Baumgärtner, Florian; Sprenger, Georg A. (Prof. Dr.)
Die in Muttermilch mit bis zu 15 g l-1 enthaltenen humanen Milcholigosaccharide (HMOs) stellen eine bedeutende Gruppe bioaktiver Naturstoffe dar und zeigten in verschiedenen wissenschaftlichen Arbeiten zahlreiche positive Effekte für die Entwicklung von Säuglingen. Mit über 200 beschriebenen und über 100 strukturell charakterisierten Oligosacchariden weisen HMOs dabei eine große Strukturvielfalt auf. Untersuchungen der physiologischen Effekte von HMOs wurden in der Vergangenheit neben wenigen isolierten oder synthetisierten Reinstoffen häufig mit HMO-Gemischen durchgeführt, welche aus humaner Milch isoliert wurden. Der Grund hierfür ist, dass chemische Synthesen wegen der benötigten Schutzgruppenchemie aufwändig sind und enzymatische Synthesen mit Leloir-Glycosyltransferasen bzw. Glycosidasen kostspielige Nukleotid-aktivierte Zucker als Substrate benötigen bzw. geringe Produktausbeuten zeigen. Durch die Kombination hoher Regio- und Stereoselektivitäten von Leloir-Glycosyltransferasen mit einer kostengünstigen Bereitstellung von Nukleotid-aktivierten Zuckern waren in der Vergangenheit Ganzzellsynthesen einiger HMOs unter Verwendung von Plasmid-basierten Expressionen rekombinanter Gene beschrieben worden. Um die Synthese weiterer HMOs mittels Ganzzellsynthesen zu ermöglichen und dabei auf die Verwendung von Selektions-Systemen für Plasmid-tragende Zellen verzichten zu können, wurden in dieser Arbeit Plasmid-freie Stämme zur Synthese verschiedener HMOs konstruiert und die damit synthetisierten Oligosaccharide isoliert sowie analysiert. Die Stammkonstruktion erfolgte dabei durch chromosomale Integration von Expressionskassetten in Zuckerdegradations-Loci mittels homologer Rekombination und Selektion auf die Ortsspezifität der Integration mittels pH-Indikator Agarplatten. Unter Verwendung verschiedener Glycosyltransferase-Gene aus Helicobacter pylori, Escherichia coli und Neisseria meningitidis in Escherichia coli-Zellen, welche Nukleotid-aktivierte Zucker bereitstellen und Lactose aufnehmen, konnten so unter anderem die HMOs 2‘-Fucosyllactose (2‘-FL), 3-Fucosyllactose (3-FL), Lacto-N-tetraose (LNT), Lacto-N-neotetraose (LNnT), Lacto-N-fucopentaose I (LNFP I) und Lacto-N-difucohexaose II (LNDFH II) synthetisiert, isoliert und charakterisiert werden. Basierend auf den bereits vor dieser Arbeit am Institut für Mikrobiologie der Universität Stuttgart konstruierten E. coli Stämmen JM109 gwBC-F1 und JM109 gwBC F2-cat konnte eine Erhöhung der Produktivität von 2‘-FL durch die Erhöhung der chromosomal integrierten Kopien des Fucosyltransferase-Gens futC aufgezeigt werden. Außerdem konnte durch die zusätzliche Nutzung des Salvage Pathway für die Synthese von GDP-L-Fucose die Produktbildung weiter erhöht werden. Dabei wurden in Schüttelkolben-Kulturen mit Plasmid-freien Stämmen 2‘-FL-Titer von 1,06 ± 0,21 g l-1 bzw. 2,00 ± 0,04 g l-1 ohne bzw. mit Nutzung des Salvage Pathway erreicht. In einer darauffolgenden, Antibiotika-freien Zulaufkultivierung mit einem Endvolumen von 13,5 l und den Kohlenstoffquellen Glycerin und Lactose wurde ein 2‘-FL-Titer von 20,28 ± 0,83 g l-1 und somit etwa 270 g 2‘ FL mit einer Raum-Zeit-Ausbeute von 0,57 g l 1 h-1 produziert. In einem weiteren Teil dieser Arbeit konnte durch die Konstruktion des Stammes E. coli LJ-AYO-cat mit integrierten Genen einer Lactose-Permease, β1,3-N-Acetylglucosaminyl-transferase und β1,3-Galactosyltransferse erstmals die Synthese des HMO LNT in rekombinanten Mikroorganismen beschrieben werden. Dabei wurde unter Verwendung von Galactose als Kohlenstoffquelle im Vergleich zu Glycerin bzw. Glucose eine höhere intrazelluläre Konzentration des Donor-Substrats UDP-Galactose bestimmt, in Schüttelkolben 0,81 ± 0,01 g l-1 LNT synthetisiert und in einer Galactose-limitierten Zulaufkultivierung ein LNT-Titer von 12,72 ± 0,21 g l-1 erreicht. Bei einer Raum-Zeit-Ausbeute von 0,37 g l-1 h-1 wurden so 173 g des Tetrasaccharids LNT produziert. Durch die Ausstattung dieses LNT-synthetisierenden Stammes mit den Genen einer α1,2 bzw. α1,4-Fucosyltransferase und dem Salvage Pathway zur Synthese von GDP-L-Fucose wurden anschließend erstmalig rekombinante Ganzzellsynthesen fucosylierter Derivate von LNT beschrieben und dabei in Schüttelkolben-Kulturen 0,272 ± 0,006 g l-1 LNFP I bzw. 0,547 ± 0,004 g l-1 LNDFH II gebildet. Die Strukturen der gebildeten HMOs konnten nach der Isolierung jeweils mittles Massenspektrometrie und NMR-Spektroskopie aufgeklärt werden. Somit konnten in dieser Arbeit die Ganzzellsynthesen verschiedener HMOs mit Plasmid-freien Stämmen dargestellt, die Titer und Raum-Zeit-Ausbeuten in der Synthese von 2‘ FL erhöht und die Auswahl der mittels Ganzzellsynthesen herstellbaren HMOs um Typ I-HMO-Strukturen erweitert werden.
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Introduction of novel artificial pathways in Escherichia coli with fructose 6-phosphate aldolase (FSA)
(2024) Guitart Font, Emma; Sprenger, Georg A. (Prof. Dr.)
Fructose 6-phosphate aldolase (FSA) enzymes are known to catalyse aldol and retroaldol reactions. These reactions have been shown in vitro by Schürmann and Sprenger (2001), Schürmann et al. (2002), Garrabou et al. (2009), Castillo et al. (2010), Sánchez-Moreno et al. (2012a and 2012b), among other groups. However, it was unclear whether these reactions would be possible in vivo. Since the discovery of FSA, encoded by the genes fsaA and fsaB in the Escherichia coli chromosome in 2001 (Schürmann and Sprenger, 2001), its true physiological function has not been reported yet (Samland and Sprenger, 2014). Due to the weak expression of the native promoters of fsaA and fsaB, the only enzymatic data reported so far are from recombinant FSA. To evaluate whether the cleavage of fructose 6-phosphate (F6P) in glycolysis, and the formation of arabinose 5-phosphate (A5P) in the synthesis of 2-keto-3-deoxymanno-octulosonic acid (KDO) could also be catalysed in vivo by FSA, E. coli mutant strains with numerous mutations in metabolic pathways were constructed. These mutant strains had blockades in central carbon metabolism or anabolism. Thus, these mutations impacted pleiotropic genes and, therefore, growth. Afterwards, it was examined if the activity of recombinant FSA in these mutant strains could restore deficiencies in growth. With the reactions catalysed by FSA, the blocked pathways were not restored, but new artificial pathways emerged. Through the F6P bypass a new route for the production of dihydroxyacetone (DHA) and glycerol was opened. Furthermore, a new approach for the provision of A5P was established.
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Kopplung von Aldolasereaktionen und der Thiamindiphosphat-abhängigen Synthase MenD zur Gewinnung funktionalisierter Feinchemikalien
(2021) Schapfl, Matthias; Sprenger, Georg A. (Prof. Dr.)
Die Knüpfung intermolekularer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen (C C Bindungen) und die Spaltung von C C Bindungen haben in vielen Stoffwechselwegen eine wichtige Bedeutung. Die Kohlenstoffkette verlängernde enzymkatalysierte Carboligationsreaktionen finden darüber hinaus in der Biokatalyse breite Anwendung. In der vorliegenden Arbeit wurden durch Aldolasen und durch das Thiamindiphosphat-(ThDP)-abhängige Enzym MenD katalysierte Reaktionen kombiniert, um hochfunktionalisierte Produkte zu erhalten. Im ersten Schritt wurde durch die Aldolasen Eda bzw. DgoA aus 50 mM Pyruvat (7) und 100 mM Glyoxylat (8) 4-Hydroxy-2-oxoglutarat (HOG, 2) gebildet. Beide Enzyme zeigten Umsätze von > 99% (Eda) bzw. von > 90% (DgoA). Die Bildung des Produktes 2 wurde für beide Aldolasen durch LC-MS-Analyse und die Struktur mittels 1H-NMR-Spektroskopie bestätigt. Mit Circulardichroismus wurde gezeigt, dass DgoA zu einem höheren Enantiomerenüberschuss der Produkte führt als Eda. Das enzymatisch gebildete HOG (Eda) (2a) bzw. HOG (DgoA) (2b) wurde zusammen mit verschiedenen Akzeptorsubstraten und MenD inkubiert. Der Umsatz der MenD-Reaktionen wurde als Abnahme des jeweils eingesetzten Akzeptorsubstrates definiert. Für die Ein-Topf-Reaktionen mit 2a bzw. 2b wurden zu dem oben beschriebenen Assay für die Gewinnung von 2a bzw. 2b zusätzlich 20 mM Akzeptorsubstrat und 0.7 mg/mL MenD hinzugefügt. MenD zeigte für die Kontrollreaktion des physiologischen Donors 2 Ketoglutarat (1) an 2,3 CHD (3) eine Abnahme des Akzeptorsubstrates von 90%. Für die 1,4 Addition von 2a an 3 wurde eine Abnahme für 3 von 78% bestimmt, die höher lag als für 2b mit 23%. Sowohl LC-MS-Messungen als auch aufgenommene 1H-NMR-Spektren zeigten, dass das jeweils aus 2a bzw. 2b und 3 gebildete 2-Malyl-5,6-dihydroxycyclohexen-1-carboxylat (MDHCHC) zu Iso MDHCHC isomerisiert, wie es durch Kurutsch et al. (2009) entsprechend für die 1,4-Addition von 1 an 3 zu 2-Succinyl-5,6-dihydroxycyclohexen-1-carboxylat (SDHCHC) bzw. Iso SDHCHC beschrieben wurde. 1H-NMR-Messungen und 1D-Tocsy-Experimente bestätigten die Decarboxylierung von 2a und die anschließende 1,4 Addition an den Cyclohexadienring von 3 unter Ausbildung eines Cyclohexenringes. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass neben 1 sowohl 2a als auch 2b als Donor für die 1,4 Addition mit Acrylsäure (4) als aliphatischem Akzeptor dienen können. Die Abnahmen des Akzeptors waren jeweils > 99% und die Produktbildung wurde mittels LC-MS bestätigt. Die 2-Stufen-Synthese bestehend aus der Bildung von 2a bzw. 2b und deren 1,4-Addition an 3 bzw. 4 konnte auf die 1,2 Addition an den aromatischen Akzeptor Benzaldehyd (5) als auch an den aliphatischen Akzeptor Hexanal (6) übertragen werden. Für die 1,2-Addition an 5 als Akzeptor lag die Substratabnahme für 1, 2a und 2b jeweils > 99% und Produktbildung wurde in allen drei Fällen mit Hilfe von LC-MS und 1H-NMR-Spektroskopie bestätigt. Produktbildung wurde auch für die 1,2-Addition von 1 als Positivkontrolle (Abnahme des Akzeptorsubstrates: 95%) und 2a bzw. 2b an 6 mittels LC-MS bestätigt. Die Abnahme des Akzeptorsubstrates 6 war für 2a mit 87% bzw. für 2b mit 62% niedriger. Das Wildtypenzym MenD ist wie viele ThDP-abhängige Enzyme spezifisch für die (R) Konfiguration der 2-Hydroxyketon-Produkte. Um Produkte mit einer gewünschten Stereokonfiguration zu erhalten, wurde für die 1,2-Addition von 1 an 5 die (S)-selektive MenD-Variante MenD_I474A_F475G (Westphal et al., 2013a) eingesetzt (Abnahme von 5: 86%). Ebenso wurden für 2a bzw. 2b als Donorsubstrate Abnahmen des Akzeptors 5 von 94% (2a) bzw. 89% (2b) gezeigt. Außerdem wurde für diese MenD-Variante gezeigt, dass sie die 1,2 Addition der Donorsubstrate 1 (91%), 2a (63%) bzw. 2b (40%) an 6 katalysiert. Die Produktbildung wurde für alle sechs Produkte mit Hilfe von LC-MS bestätigt. Auf diesen Ergebnissen aufbauend wurde MenD_I474A_F475G in der vorliegenden Arbeit erstmals für 1,4 Additionsreaktionen eingesetzt. Es wurde die Eignung dieser Variante für die 1,4-Addition gezeigt, die Abnahme des Akzeptors betrug für die 1,4-Addition von 1 und 4 > 99%. Darüber hinaus akzeptiert diese MenD-Variante auch 2a und 2b als Substrat für die 1,4 Addition an 4 (Substratabnahme für 2a: 76% bzw. für 2b: 76%). Zudem wurden weitere Akzeptorsubstrate (Salicylaldehyd, 3-Formylchromon und 2 Amino-3 formylchromon) und Monocarbonsäuren (2-Ketobutyrat und 3-Methyl-2-ketobutyrat) als Donoren für MenD eingeführt. Auf Grund der fehlenden Carboxylgruppe ist die Stabilisierung der Monocarbonsäuren schlechter als die des pyhsiologischen Donors 1. In der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe von Enzymreaktionen funktionalisierte Substrate hergestellt, die als Donoren für MenD dienen. Nachdem 2 als neuer Donor für MenD eingeführt werden konnte, könnte diese 2-Stufen-Synthese in andere Stoffwechselwege von Bakterien integriert werden.