Browsing by Author "Stolz, Andreas (Prof.)"

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    Molekularbiologische Untersuchungen des Abbauweges von 4-Sulfocatechol durch Hydrogenophaga intermedia S1 und Agrobacterium radiobacter S2
    (2006) Halak, Sad; Stolz, Andreas (Prof.)
    Eine bakterielle Zweispezies-Kultur aus den Stämmen Hydrogenophaga intermedia S1 und Agrobacterium radiobacter S2 wurde untersucht. Diese Mischkultur war in der Lage, den naturfremden Stoff 4-Aminobenzolsulfonat (4ABS) als einzige Kohlenstoff-, Stickstoff-, Schwefel- und Energiequelle zu nutzen. In der Mischkultur oxidiert der Stamm S1 das 4ABS zu 4-Sulfocatechol (4SC), welches als zentraler Metabolit im bakteriellen Abbau von anderen substituierten Benzolsulfonaten identifiziert wurde. 4SC wird zum Teil in das Medium ausgeschieden und von dem Stamm S2 aufgenommen. Das 4SC wird von den beiden Stämmen über einen dem Protocatechuat-Zweig des β-Ketoadipat-Weges analogen Stoffwechselweg abgebaut. Hierbei wird 4SC von den beiden Stämmen durch eine intradiole Ringspaltung zu 3-Sulfomuconat (3SM) umgesetzt. 3-Sulfomuconat wird anschließend zu 4-Carboxymethylen-4-sulfobut-2-en-olid (4-Sulfolacton, 4SL) durch 3-Carboxymuconat-Cycloisomerasen (CMLE) cycloisomerisiert. Die Desulfonierung des 4-Sulfolactons zu Maleylacetat (MA) erfolgt durch 4-Sulfolacton-Hydrolasen (SLH). Maleylacetat wird daraufhin von den Stämmen S1 und S2 mit Hilfe von Maleylacetat-Reduktasen zu β-Ketoadipat reduziert. Es wurde in früheren Untersuchungen gezeigt, dass die 4SC oxidierenden Enzyme aus den Stämmen S1 und S2 auch Protocatechuat und die 3SM umsetzenden Aktivitäten auch 3-Carboxy-cis,cis-muconat (3CM) als Substrate akzeptierten. Aus diesem Grund wurden die Enzyme, die nur Protocatechuat und dessen Folgeprodukte umsetzen, als Typ I Enzyme bezeichnet. Dagegen wurden die Enzyme, die auch die sulfonierten Struktur-Analoga umsetzen, als Typ II Enzyme angesprochen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die weiteren am 4-Sulfocatechol Abbauweg beteiligten Enzyme charakterisiert. Hierbei wurde zunächst der Umsatz von 3SM zu 4SL im Vergleich mit dem Umsatz von 3CM zu 4-Carboxymuconolacton (4CL) untersucht. Hierzu wurden die Gene pcaB1 und pcaB2 aus den Stämmen S1 und S2 in E. coli überexprimiert. Die kodierten CMLEs Typ I und Typ II wurden aufgereinigt und charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass sowohl die CMLEs vom Typ II aus H. intermedia und A. radiobacter (HiCMLE2 und ArCMLE2) als auch die CMLE von Typ I aus A. radiobacter (ArCMLE1) 3SM zu 4SL umsetzten. Die grundlegenden kinetischen Parameter der drei Enzyme wurden mit 3CM und 3SM als Substrate bestimmt. Obwohl die HiCMLE2 und ArCMLE2 eine gewisse Spezialisierung an den Umsatz von 3SM zeigten (Vmax = 53 bzw. 29,5 U/mg mit 3SM im Vergleich zu 1,5 bzw. 1,3 U/mg mit 3CM), besaß die ArCMLE1 eine höhere spezifische Aktivität mit 3SM als Substrat (Vmax = 130 U/mg mit 3SM im Vergleich zu 2270 U/mg mit 3CM). Die Gene, die für die 4-Sulfolacton-Hydrolasen kodierten, konnten „downstream“ der pcaB2-Gene in den beiden Stämmen identifiziert werden. Die Gene wurden in E. coli exprimiert und die 4-Sulfolacton-Hydrolasen aufgereinigt und charakterisiert. Die SLH aus H. intermedia (HiSLH) setzte 4SL mit höheren Vmax- und Km-Werten als das Enzym aus A. radiobacter (ArSLH) um, allerdings waren die katalytischen Konstanten der beiden Enzyme sehr ähnlich (kcat/Km = 1417 mM-1 min-1 für HiSLH im Vergleich zu 1233 mM-1 min-1 für ArSLH). Beim Umsatz von 4-Sulfolacton wurde die Freisetzung annähernd äquimolarer Mengen von Maleylacetat und Sulfit nachgewiesen. 4-Sulfolacton (4SL) zeigte eine Strukturähnlichkeit zu 2-Pyron-4,6-dicarboxylat (PDC), einem Intermediat in einem extradiolen Abbauweg von Protocatechuat über eine Protocatechuat-4,5-Dioxygenase Reaktion. Es wurden signifikante Sequenzähnlichkeiten zwischen den 4-Sulfolacton-Hydrolasen aus den Stämmen S1 und S2 und der 2-Pyron-4,6-dicarboxylat-Hydrolase (PDCH) aus dem Stamm S. paucimobilis nachgewiesen. Umsatzversuche mit 4SL und PDC zeigten, dass HiSLH und ArSLH eine eigenständige Gruppe von Enzymen darstellen, da die SLHs kein PDC und die PDHC kein 4SL umsetzten. Weiterführende Sequenzvergleiche zeigten Sequenzähnlichkeiten zwischen den carboxyterminalen Bereichen der 4-Sulfolacton-Hydrolasen und den zyklischen Amidasen, zu denen Enzyme wie z.B. D-Hydantoinasen und Dihydropyrimidasen gehören, die Mn2+-, Mg2+-, Zn2+-, Ni2+- oder Co2+- Ionen in ihren aktiven Zentren beinhalten. Deshalb wurde der Metallgehalt der HiSLH mittels Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) bestimmt, wobei Zn2+-Ionen im aktiven Zentrum der HiSLH identifiziert wurden. Abschließend wurde der Abbauweg von 4SC durch die rekombinanten Enzyme mittels in-situ 1H-Kernresonanzspektroskopie bestätigt und die Entstehung jedes Reaktionsprodukts im Verlauf des Abbauweges nachgewiesen.