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    Die enzymatische Hydrolyse von Nitrilen unter sauren Bedingungen durch neu isolierte und rekombinante Mikroorganismen und die Verwendung von säuretoleranten Ganzzellbiokatalysatoren zur enantioselektiven Synthese von α-Hydroxycarbonsäuren
    (2011) Rustler, Sven; Stolz, Andreas (Prof. Dr.)
    Enantiomerenreine α-Hydroxycarbonsäuren stellen bedeutende Ausgangsstoffe für die Synthese einer Vielzahl von (chiralen) Verbindungen dar. Die enzymatische Umsetzung von α-Hydroxy-nitrilen stellt eine Möglichkeit zur enantioselektiven Synthese von α-Hydroxycarbonsäuren dar. Hierbei können entweder racemische oder enantiomerenreine α-Hydroxynitrile als Ausgangssubstrate dienen. Die Enantiomerenüberschüsse der Produkte dieser Biotransformationen werden durch die Instabilität der α-Hydroxynitrile in wässrigen Medien und die spontane chemische Hydrocyanierung der Zerfallsprodukte limitiert. Diese unerwünschten Nebenreaktionen können durch die Verwendung saurer Reaktionsmedien unterdrückt werden. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit die enzymatische Hydrolyse von Nitrilen unter sauren Bedingungen untersucht. Das Ziel war es hierbei, die enantioselektive Synthese von (S)-α-Hydroxycarbonsäuren ausgehend von Aldehyden und Cyanid zu ermöglichen. Als Modellreaktion wurde die Synthese von (S)-Mandelsäure angestrebt. Anfängliche Stabilitätstest zeigten, dass Mandelonitril in wässrigen Medien bei pH-Werten <5 weitgehend stabil vorliegt. Daher wurde die Biotransformation von Mandelonitril bei pH-Werten ≤5 untersucht. Als Biokatalysator wurde E. coli JM109(pIK9) eingesetzt, der eine Arylacetonitrilase aus Pseudomonas fluorescens EBC191 rekombinant synthetisiert. Ruhezellen und Rohextrakte von E. coli JM109(pIK9) setzten Mandelonitril bei pH-Werten von 4-7 zu Mandelsäure und Mandelsäureamid um. Ruhezellen hydrolysierten Mandelonitril mit signifikant höheren Aktivitäten als Rohextrakte und setzten Mandelonitril in Konzentrationen ≤150 mM um. Es konnte somit deutlich gezeigt werden, dass die eingesetzten E. coli Ganzzell-Katalysatoren prinzipiell für die angestrebte Biotransformation geeignet sind. Die Arylacetonitrilase aus P. fluorescens EBC191 wurde zum Vergleich auch in der säuretoleranteren Hefe Pichia pastoris exprimiert. Ruhezellen des rekombinanten Stamms setzten Mandelonitril bei pH 3-7 um. Die simultane Expression der (S)-Oxynitrilase aus Maniok (Manihot esculenta) und der Arylacetonitrilase aus P. fluorescens EBC191 in P. pastoris führte zu einem “bienzymatischen Ganzzellkatalysator“, welcher die Transformation von Benzaldehyd und KCN zu (S)-Mandelsäure und (S)-Mandelsäureamid bei pH 3,8 katalysierte. Es wurden Anreicherungen bei pH 3 und 4 mit Phenylacetonitril als Stickstoffquelle durchgeführt. Hierbei wurden Inokula aus verschiedenen sauren Biotopen verwendet. Es wurde ein neues Isolat der „schwarzen Hefe“ Exophiala oligosperma angereichert, das Phenylacetonitril als einzige Stickstoff-, Kohlenstoff und Energiequelle nutzen konnte. E. oligosperma R1 setzte Phenylacetonitril zu Phenylessigsäure um und metabolisierte dieses Intermediat über 2-Hydroxyphenylessigsäure zu Homogentisat, welches dann zu Maleylacetoacetat oxidiert wurde. Ruhezellen von E. oligosperma R1 hydrolysierten Phenylacetonitril bei pH-Werten von 1,5-9. Phenylacetonitril wurde von E. oligosperma R1 wahrscheinlich durch eine Nitrilase umgesetzt. Die höchsten Nitrilase-Aktivitäten wurden nach Anzucht des Organismus in Gegenwart von 2-Cyanopyridin erreicht. Rohextrakte aus derart induzierten Zellen setzten eine Vielzahl unterschiedlich ringsubstituierter Benzonitrile, Phenylacetonitrile, Cyanopyridine, sowie Mandelonitril, Phenylpropionitril und Acrylonitril zu den korrespondierenden Carbonsäuren um. Spuren von Carbonsäureamiden konnten nur in wenigen Umsätzen nachgewiesen werden. Der Vergleich der Nitrilase-Aktivität von E. oligosperma R1 mit verschiedenen anderen Nitrilasen aus Pilzen zeigte, dass die Nitrilase aus E. oligosperma R1 ein breiteres Spektrum an Nitrilen hydrolysierte. Die potentielle Nutzbarkeit des neuen Biokatalysators wurde durch den Umsatz von 2-Hydroxy-3-butennitril zu 2-Hydroxy-3-butensäure durch Ruhezellen von E. oligosperma R1 bei pH 4 verifiziert.
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    Steigerung der Nitril-Hydratase-Aktivität der Nitrilase aus Pseudomonas fluorescens EBC191
    (2013) Sosedov, Olga; Stolz, Andreas (Prof. Dr.)
    Chirale 2-Hydroxycarbonsäuren und 2-Hydroxycarboxamide sind wichtige Syntheseprodukte in der organischen Chemie. Die enzymatische Synthese von optisch aktiven 2-Hydroxycarboxamiden und 2-Hydroxycarbonsäuren kann prinzipiell aus optisch aktiven Cyanhydrinen (2-Hydroxynitrilen) unter Verwendung von Nitril-Hydratasen oder Nitrilasen erfolgen. Die praktische Anwendung von Nitril-Hydratasen in der Synthese der 2-Hydroxycarboxamide wird durch Probleme bei der rekombinanten Expression, der Substratspezifität und der Cyanid-Sensitivität vieler Nitril-Hydratasen limitiert. Die beschriebenen Probleme könnten möglicherweise durch den Einsatz von Nitrilasen umgangen werden, da viele Nitrilasen neben ihren Hauptprodukten (den korrespondierenden Carbonsäuren) auch die entsprechenden Amide als Nebenprodukte bilden. Die Nitrilase aus dem Bakterium Pseudomonas fluorescens EBC191 setzt eine Vielzahl an 2-substituierten Nitrilen zu Produktgemischen mit unterschiedlichen Säure/Amid-Verhältnissen um und weist in einigen Fällen eine signifikante Nitril-Hydratase-Aktivität auf. Daher wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit diese Nitrilase mit den Methoden des Protein Engineering dahingehend modifiziert, dass sie Nitrile primär zu Amiden umsetzte. Es wurden hierbei Strategien des rationalen Protein-Designs und der gerichteten Evolution eingesetzt. Aus vorangegangenen Arbeiten waren Nitrilasevarianten bekannt, die nach Deletionen des C-terminalen Bereichs oder durch unterschiedliche Aminosäure-Austausche in der Nähe des katalytischen Zentrums erhöhte Nitril-Hydratase-Aktivitäten aufwiesen. Hierbei waren Enzymvarianten gefunden worden, die aus (R,S)-Mandelonitril bis zu 50% Mandelamid bildeten. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Enzymvarianten erzeugt, die diese Mutationen in verschiedenen Kombinationen enthielten. Hierbei konnte ein kumulativer Effekt beobachtet und Enzymvarianten generiert werden, die aus (R,S)-Mandelonitril bis zu 70% Mandelamid produzierten. Im Rahmen der gerichteten Evolution der Nitrilase aus P. fluorescens EBC191 wurde mit Hilfe einer fehlerbehafteten PCR eine Bibliothek des modifizierten Nitrilasegens erzeugt. Ein Screening-Verfahren wurde entwickelt und optimiert, dass es ermöglichte, gesteigerte Nitril-Hydratase-Aktivitäten der Enzymvarianten in Kolonien rekombinanter Zellen über die chromogene Bildung von Fe(III)-Hydroxamat-Komplexen zu identifizieren. Die Screening-Methode basierte auf der Acyltransferase-Aktivität einer Amidase, die daher gemeinsam mit einzelnen Nitrilasevarianten in E. coli-Zellen exprimiert werden musste. Es wurden ca. 4200 Klone mit Hilfe des Screening-Verfahrens untersucht. Bei 30 Klonen zeigte die Intensität des gebildeten Fe(III)-Hydroxamat-Komplexes an, dass diese Klone Enzymvarianten mit signifikant höheren Nitril-Hydratase-Aktivitäten als der Wildtyp enthielten. Anschließend wurde der Umsatz von (R,S)-Mandelonitril durch diese Klone mit Hilfe der HPLC analysiert. Hierbei wurden Enzymvarianten gefunden, die aus (R,S)-Mandelonitril bis zu 90% Mandelamid bildeten. Dies bedeutete im Vergleich zum Wildtyp eine annähernd 5-fache Steigerung der Nitril-Hydratase-Aktivität. Die Nitrilase-Gene der im Rahmen der Zufallsmutagenese erhaltenen positiven Mutanten wurden sequenziert und eine Reihe von Aminosäure-Austauschen identifiziert, die zu einer erhöhten Amidbildung führten und die noch nicht aus den früheren Arbeiten bekannt waren. Hierbei wurde gezeigt, dass insbesondere der Austausch eines Tryptophan-Rests in der Position 188 der Nitrilase zu Enzymvarianten mit sehr hohen Nitril-Hydratase-Aktivitäten führte. Nach einer Sättigungsmutagenese an dieser Position wurden Enzymvarianten erhalten, die ca. 94% Mandelamid im Produktgemisch aufwiesen. Im Verlauf der vorliegenden Arbeit gelang es somit, eine beinahe vollständige funktionelle Umwandlung der Nitrilase aus P. fluorescens EBC191 in eine Nitril-Hydratase zu erreichen. Die so erhaltenen Nitrilasevarianten wurden in enzymatischen Kaskadenreaktionen zur Synthese von optisch aktiven 2-Hydroxycarboxamiden eingesetzt. Hierzu wurden rekombinante E. coli Ganzzell-Katalysatoren konstruiert, die eine Nitrilasevariante mit gesteigerter Nitril-Hydratase-Aktivität zusammen mit einer (S)-spezifischen Oxynitrilase aus der Cassava-Pflanze (Manihot esculenta) oder einer (R)-spezifischen Oxynitrilase aus der Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana) co-exprimierten. Die so erhaltenen Ganzzell-Katalysatoren setzten in wässrigen schwach sauren Puffer-Lösungen Benzaldehyd und Cyanid zu (S)- oder (R)-Mandelamid um. Hierbei wurden mit beiden "bienzymatischen" Ganzzell-Katalysatoren hohe Produktausbeuten und Enantiomerenüberschüsse > 90% erzielt. Die so erzeugten Ganzzell-Katalysatoren stellen eine synthetisch interessante Möglichkeit zur Herstellung verschiedenster optisch aktiver 2-Hydroxycarboxamide dar.