Browsing by Author "Sun, Tianqi"

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Regulation des Mannose-Operons in Bacillus subtilis
(2010) Sun, Tianqi; Mattes, Ralf (Prof. Dr. rer. nat.)
Das Mannose-Operon in B. subtilis besteht aus drei Genen, manP, manA und yjdF, von denen aber nur manP und manA für die Verwertung der Mannose notwendig sind. Stromaufwärts und in derselben Orientierung wie das Mannose-Operon liegt das regulatorische Gen manR. Dieses codiert den Transkriptionsaktivator für die Expression des Mannose-Operons und des eigenen Gens, die beide durch Mannose induzierbar sind. Mit lacZ als Reportergen verursachte die Zugabe von Mannose eine 4-7-fache Erhöhung der Transkriptionsrate des manP-Promotors (PmanP), und eine circa 3-fache Erhöhung des manR-Promotors (PmanR). Durch "Primer Extension"-Experimente wurde der Transkriptionsstart von manPA-yjdF und manR identifiziert. Die aus diesem Transkriptionsstart abgeleiteten –35- und –10-Regionen der beiden Promotoren stimmen mit der Konsensussequenz von vegetativen sA abhängigen Promotoren überein. Eine Deletion von manR bewirkte ein nahezu vollständiges Abschalten beider Promotoren. Durch Deletionsanalyse wurde die Lage der Operatorsequenz von ManR zwischen den Basenpaaren -79 und -35 bezüglich des Transkriptionsstarts von manPA-yjdF und zwischen -81 und -35 bezüglich des Transkriptionsstarts von manR bestimmt. Ein Austausch dieser Region gegen eine entsprechende Region eines Mannitol-Operons führte dazu, dass die entsprechenden Hybridpromotoren nun durch Mannitol regulierbar wurden. Eine Deletion von manP (Mannose-Transporter) hatte eine konstitutive Expression von PmanP und PmanR zur Folge. Dagegen führte eine Deletion von manA (Mannose-6-Phosphat-Isomerase) zur Sensitivität gegen Mannose. Anhand von Aminosäurensequenz-Vergleichen wurden in ManR fünf Domänen postuliert, nämlich eine N-terminale DNA-Bindedomäne, zwei PRDs, eine PTS-EIIA- und eine PTS-EIIB-ähnliche Domäne am C-Terminus. Die Deletion der EIIA- und EIIB-ähnlichen Domänen führte zu einer konstitutiven Expression von PmanP und PmanR. Da die Deletion des Gens für den Mannose-Transporter ebenfalls zur Konstitutivität führte, wurde gefolgert, dass es eine Phosphatübertragung zwischen Transporter und Regulator gibt, die die Aktivität von ManR beeinflusst. In Analogie zu anderen PRD-Regulatoren sollte die PRDI in Abwesenheit von Mannose phosphoryliert vorliegen und in Anwesenheit von Mannose durch den Mannosetransporter dephosphoryliert werden. Tatsächlich spielt wie auch bei anderen PRD-Regulatoren die PEP-abhängige Phosphorylierung an His15 von HPr eine essentielle Rolle bei der Aktivierung von PmanP und PmanR. Außerdem unterliegen sowohl PmanP als auch PmanR der Kohlenstoff-Katabolitrepression (CCR). Aufgrund der Homologie von ManR zu anderen PRD-haltigen Transkriptionsaktivatoren kann man davon ausgehen, dass die PRDII in Abwesenheit von Glucose phosphoryliert und in Anwesenheit von Glucose dephosphoryliert ist. Der Mannose-Regulator ist demnach nur aktiv, wenn PRDI dephosphoryliert und PRDII phosphoryliert ist, also wenn nur Mannose ohne Glucose im Medium vorliegt. Genau dieses Verhalten wurde an den beiden Mannose-Promotoren beobachtet. Dies überlappt mit einem zweiten, für B. subtilis bekannten Mechanismus der Katabolitrepression, dessen zentrale Bestandteile der Repressor CcpA, HPr und HPr-Kinase sind. Bei einem Überschuss an Intermediaten der Glykolyse, insbesondere Fruktose-1,6-biphosphat wird die HPr-Kinase stimuliert, die ATP-abhängig HPr an Ser46 phosphoryliert. Dieses bindet an CcpA und der Komplex bindet schließlich an sogenannte cre-Sequenzen in entsprechenden CCR-regulierten Promotoren. Tatsächlich konnte eine cre-Sequenz im manR-Promotor identifiziert werden. Eine Mutation der Sequenz führte zu einer Erniedrigung der Katabolitrepression der Mannose-Promotoren. Eine geringe Erniedrigung der CCR wurde auch in der ptsH-S46A-Mutante und einer Deletionsmutante des zu HPr homologen crh beobachtet, aber erst in der ptsH-S46A Δcrh Doppelmutante war die CCR auf PmanP and PmanR stark reduziert. Dies zeigte, dass die beiden Proteine sich offensichtlich in der Funktion komplementieren. Zusammengefasst lässt sich sagen, dass durch diese Arbeit ein autoregulatorisches System für die Mannose-Verwertung in Bacillus subtilis bezüglich Induktion und Katabolitrepression weitgehend aufgeklärt wurde und aufgrund des starken manP Promotors eine Anwendung in der Konstruktion von Expressionsvektoren finden sollte.