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Proteinqualitätskontrolle im endoplasmatischen Retikulum: Variationen im Abbaumechanismus von löslicher und membrangebundener missgefalteter CarboxypeptidaseY (CPY*)
(2002) Taxis, Christof; Wolf, Dieter, H. (Prof. Dr.)
Geregelter Proteinabbau ist eine Möglichkeit für eukaryontische Zellen Stoffwechselwege und Enzymaktivität zu regulieren. Dies ermöglicht ihnen Wachstum, Differenzierung und metabolische Adaption. Der Abbau nicht funktioneller oder falsch gefalteter Proteine schützt die Zelle vor Proteinablagerungen, die Zellfunktionen entscheidend stören und zur Entwicklung von Krankheiten, wie Alzheimer oder Parkinson, führen können. Eine wichtige Aufgabe ist hierbei die Kontrolle der Proteine, in Bezug auf ihre intakte Struktur, die für das sekretorische System bestimmt sind und ihren Wirkungsort im endoplasmatischen Retikulum (ER), dem Golgi Apparat, der Vakuole oder an der Plasmamembran haben. Alle diese Proteine unterzieht die Zelle nach dem Transport ins ER einer Qualitätskontrolle; falsch gefaltete Proteine werden zurückgehalten und dem Abbau über das zytosolische Ubiquitin-Proteasom-System zugeführt. In der vorliegenden Arbeit wurde der Abbau von drei unterschiedlichen Substraten verglichen, die von der Qualitätskontrolle im ER erkannt und dem Abbau zugeführt werden. Alle drei Substrate besitzen den gleichen, falsch gefalteten Proteinteil im Lumen des ER, die punktmutierte Carboxypeptidase yscY (CPY*). Es wurde untersucht, ob Komponenten der Abbaumaschinerie variieren, wenn an CPY* eine Transmembrandomäne (CPY*-Transmembrandomäne, Abk.: CT*) oder noch zusätzlich zur Transmembrandomäne das grün fluoreszierende Protein (GFP) als zytosolische Domäne angefügt wird (CPY*-Transmembrandomäne-GFP, Abk.: CTG*). Es konnte gezeigt werden, dass CT* und CTG* Typ I Membranproteine sind, deren N-terminale, CPY* enthaltende Teile glykosyliert werden und sich im ER-Lumen befinden, wohingegen deren C-terminale Teile im Zytosol lokalisiert sind. Aus früheren Arbeiten waren einige der zum Abbau von CPY* notwendigen Proteine bekannt. Es wurde deshalb untersucht, ob sie auch bei der Degradation von CT* und CTG* eine Rolle spielen. Es wurde festgestellt, dass CT* und CTG*, wie CPY*, über das zytosolische Ubiquitin-Proteasom-System abgebaut werden. Die Degradation beider Substrate ist in proteasomalen Mutanten verlangsamt. Ebenso sind zum Abbau die Ubiquitin übertragenden Proteine Ubc1p und Ubc7p zusammen mit der Ubiquitin-Ligase Der3/Hrd1p notwendig. Des Weiteren wurde gefunden, dass die AAA-ATPase Cdc48p benötigt wird. Dagegen wird Kar2p, ein Chaperon aus dem ER Lumen, nur für den Abbau von CPY* gebraucht, nicht jedoch für CT* und CTG*. Zusätzlich wurde untersucht, ob die Ssa-Familie der zytosolischen Hsp70 Chaperone Einfluss auf den Abbau von CT* und CTG* ausübt. Es war bekannt, dass diese Chaperone nicht für den Abbau von löslichen Substraten benötigt werden. Es wurde gefunden, dass sie für die Degradation von CTG* essenziell sind, nicht jedoch für CT*. Die Chaperone sind vermutlich nötig, um die zytosolische GFP-Domäne in CTG* zu entfalten. Im Rahmen der Arbeiten zum Einfluss der AAA-ATPase Cdc48p auf den CPY* Abbau wurde festgestellt, dass eine Blockierung des Transportes vom ER zum Golgi einen Defekt im Abbau von CPY* zur Folge hat. Dies ist wahrscheinlich auf eine Reduzierung des ER oder die Misslokalisierung von Kar2p in diesen Transportmutanten zurückzuführen. Doppelmutanten, die Transportdefekte zwischen ER und Golgi aufweisen und gleichzeitig die Fähigkeit verloren haben, auf ungefaltete Proteine im ER zu reagieren, können CPY* praktisch überhaupt nicht mehr abbauen. Eine Haemagglutinin-Tag (HA) Version von CPY* wurde mit Hilfe von elektronenoptischen Aufnahmen in der Hefezelle lokalisiert. CPY* kann bei Blockade des Abbaus aus dem ER entkommen und findet sich dann im Golgi, der Vakuole und sezerniert im Medium. Diese Sekretion von CPY* konnte unabhängig hiervon auch biochemisch mit Hilfe von Immunodetektion bestätigt werden. Darüberhinaus wurde festgestellt, dass die Vakuole zum Abbau von CPY* in Dder1 Zellen beiträgt. In Mutanten, die Defekte im Abbau von missgefalteten Proteinen aus dem ER aufweisen, wird die Morphologie des ER und Golgi verändert und der Transport von Wildtyp CPY durch das sekretorische System verlangsamt.