Browsing by Author "Thews, Elmar"

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    Einzelmolekülmessungen mit Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie und Fluoreszenzkreuzkorrelationsspektroskopie in lebenden Zellen
    (2005) Thews, Elmar; Wrachtrup, Jörg (Prof. Dr.)
    Die Einzelmolekülmikroskopie entwickelte sich in den letzten Jahren zu einer vielversprechenden Methodensammlung zur Messung der Dynamik selbst kleinster Molekülkonzentrationen in vivo. Diese Abhandlung besteht inhaltlich aus zwei Teilen: (i) Totale Interne Reflexions Fluoreszenz (TIRF) Mikroskopie zur Messung von Membranproteinen - ein Kanalprotein (Connexin46) und einen Rezeptor (TNF-R2) - in der Plasmamembran von lebenden menschlichen Krebszellen. (ii) crosstalkfreie Fluoreszenz Kreuz-Korrelations Spektroskopie (FCCS) zur Bestimmung der Kolokalisation von mit autofluoreszierenden Proteinen markierten Molekülen in lebenden Zellen. Der erste Teil enthält die Beschreibung der selbstgebauten aufrechten und inversen, prismenlosen TIRF Mikroskope mit Einzelmoleküldetektionsempfindlichkeit. Sie dienten zur Messung der Bewegungsmodi - brownsche Diffusion, anomale Diffusion, eingeschränkte Diffusion und Drift/gerichteter Transport - von Connexin-Halbkanälen und TNF-R2 Rezeptoren in der Plasmamembran von lebenden Zellen. Die Ergebnisse werden mit Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie (FCS) Messungen an den gleichen Systemen verglichen, um die Stärken und Schwächen der jeweiligen Methode hervorzuheben. Der zweite Teil beschreibt die Idee - und dessen Realisierung - zu einem crosstalkfreien FCCS Aufbau für die, in der Zellbiologie wegen ihrer Spezifität und Ungiftigkeit für Zellen weit verbreiteten, autofluoreszierenden Proteine Cyan Fluoreszierendes Protein (ECFP) und Gelb Fluoreszierendes Protein (EYFP) durch Diskriminierung der Fluoreszenz im Anregungsspektrum anstatt, wie üblich, im Emissionsspektrum. Dies wird mit gepulster Anregung mit zwei alternierenden Laserfrequenzen und der Detektion jedes einzelnen Fluoreszenzphotons mit einer time correlated single photon counting Karte erreicht, deren Ausgabe zur Berechnung der Auto- und Kreuzkorrelationsfunktionen herangezogen wird. Letztere gibt den Grad der Kolokalisation an. Dieses Kapitel enthält den Aufbau und die Testmessungen in Lysaten und an bichromatisch markierten Connexin46-Hexameren in lebenden Zellen.