Browsing by Author "Trodler, Peter"

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Untersuchung von Lipasen - Elektrostatik, Selektivität und Einfluss von Lösungsmitteln auf Struktur und Dynamik
(2008) Trodler, Peter; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Lipasen katalysieren die Hydrolyse von Estern und die Veresterung. Lipasen sind Biokatalysatoren mit hoher Selektivität, einem breiten Substratspektrum unter milden Bedingungen und sind wichtig in der Anwendung in organischen Synthesen. Ein Merkmal der meisten Lipasen ist die Grenzflächenaktivierung an einer hydrophoben Grenzschicht. Die meisten Lipasen haben einen Deckel, das lid, ein bewegliches Strukturelement das den Zugang zum aktiven Zentrum verschließt. Die Grenzflächenaktivierung ist verbunden mit einem Konformationsübergang von der geschlossenen zur offenen Konformation. Bei Kontakt an eine hydrophobe Grenzfläche wird das lid geöffnet und erlaubt dem Substrat den Zugang zum aktiven Zentrum. Die Eigenschaften von Lipasen, wie Temperaturstabilität, Selektivität oder Aktivität ändern sich beim Wechsel des Lösungsmittels. In dieser Arbeit wurde der Einfluss organischer Lösungsmittel auf die Struktur und die Dynamik von Lipasen durch Simulationen untersucht. Candida antarctica Lipase B (CALB) ist die wichtigste Lipase in der industriellen organischen Synthese. Im Gegensatz zu den meisten anderen Lipasen hat CALB kein lid und zeigt keine Grenzflächenaktivierung. CALB ist in organischem Lösungsmittel stabil und kann Reaktionen bei höheren Temperaturen katalysieren. Durch Simulationen sollte das Verhalten von CALB in den Lösungsmitteln Methanol, Chloroform, Isopentan, Cyclohexan, Toluol und Wasser untersucht werden. Die Struktur war in allen Lösungsmitteln stabil. Das umgebende Lösungsmittel hatte einen großen Einfluss auf die Flexibilität von CALB, bei einer höheren Dielektrizitätskonstante des Lösungsmittels nahm die Flexibilität zu. Bei kleineren Dielektrizitätskonstanten des Lösungsmittels nahm die Zahl der an die Oberfläche gebundenen Wassermoleküle zu. Durch die größere Zahl an langsam ausgetauschten Wassermolekülen an der Oberfläche bildete sich ein umspannendes Wassernetzwerk. Der Grund der verringerten Flexibilität von CALB in unpolaren Lösungsmitteln war die geringere Beweglichkeit von Wassermolekülen an der Oberfläche und deren langsamerer Austausch. Burkholderia cepacia Lipase (BCL) wurde in Simulationen untersucht. BCL hat ein lid und zeigt Grenzflächenaktivierung an einer hydrophoben Grenzschicht. Zur Untersuchung der Grenzflächenaktivierung wurden Simulationen der offenen und geschlossenen Konformation von BCL in Wasser und Toluol durchgeführt. In der geschlossenen Konformation von BCL in Wasser blieb das lid geschlossen. In Simulationen von geschlossenem BCL in Toluol wurde die Öffnung des lids beobachtet. Die vollständige Öffnung des lids wurde in der Simulation durch Helix α6 blockiert und verhinderte die weitere Bewegung von Helix α5 zur geöffneten Konformation. In der Simulation von offenem BCL in Wasser wurde eine Schließbewegung des lids beobachtet die durch Wechsel des Lösungsmittels reversibel war. In der Simulation der offenen Kristallstruktur in Toluol zeigte das lid eine etwas weitere Öffnung als zu Beginn der Simulation. Kristallkontakte verhindern eine vollständig geöffnete Konformation in der Kristallstruktur. Theoretische Untersuchungen wurden auch mit der experimentellen Arbeit verbunden. Durch rationales Design wurde eine neue einstufige Aufreinigungsmethode für CALB entwickelt. Im Allgemeinen können Lipasen durch Ionen-Austausch Chromatographie aufgereinigt werden. CALB konnte jedoch bisher nicht auf Säulen in der Ionen-Austausch Chromatographie oder der Hydrophoben-Interaktions Chromatographie unter den verwendeten Bedingungen gebunden werden. Bei der elektrostatischen Charakterisierung von CALB wurde ein breiter isoelektrischer Bereich, an Stelle eines isoelektrischen Punkts gefunden. Eine einstufige Aufreinigungsmethode durch Ionen-Austausch Chromatographie für CALB mit Bindung bei pH 3 wurde entwickelt. Das rationale Design einer Aufreinigungsmethode kann auch zur Entwicklung von Aufreinigungsmethoden anderer Proteine verwendet werden. Acrylierung dient zur Einführung von Vernetzungs-Funktionalität in Verbindungen. Chemische Prozesse zur Herstellung von acrylierten Estern bei hohen Temperaturen führen gleichzeitig zur teilweisen Polymerisierung der acrylischen Doppelbindungen. Die Acrylierung von Hydroxypropylcarbamaten sollte für einen biotechnologischen Prozess durch CALB etabliert werden. Die Methode des rationalen Designs wurde zur Erhöhung der Aktivität der Acrylierung von Hydroxypropylcarbamaten durch CALB bis zur vollständigen Umsetzung verwendet. Hydroxypropylcarbamat besteht aus zwei Enantiomerenpaaren von denen ein Enantiomer von CALB kaum acryliert wird. Das schlecht umgesetzte Substrat wurde durch Modellierung identifiziert und Mutanten mit höherer Aktivität vorgeschlagen. Die zur Vergrößerung der Bindetasche des sekundären Alkohols vorgeschlagenen Mutanten an Position 278 waren in der Hydrolyse von Tributyrin und der Acrylierung aktiver als der WT.