Browsing by Author "Wege, Christina (apl. Prof. Dr.)"

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Open Access
Control mechanisms over the RNA-guided self-assembly of tobacco mosaic virus-based nanotemplates
(2022) Schneider, Angela; Wege, Christina (apl. Prof. Dr.)
Both size and arrangement of well-defined regions of different surface chemistries on individual nanoparticles are limited by their respective fabrication processes. Tobacco mosaic virus (TMV), a plant virus that is nonpathogenic to humans, can be produced inexpensively and in large quantities in a greenhouse. Its self-assembly from single-stranded ribonucleic acid (RNA) of 6395 nt with 2130 identical copies of its coat protein (CP) makes TMV an outstanding and versatile tool for bionanotechnology. The formation of TMV-like particles (TLPs) can be easily induced in vitro – even from synthetic RNAs containing the TMV origin of assembly (OAs) and with genetically modified TMV CP types, of which, moreover, different variants can also be incorporated together into single particles. To be of interest for a wide range of applications, such as imaging and diagnostic tools, templates for microarrays, electronic devices, and biosensors, a large number and variety of possible binding types between CPs and functional molecules, as well as well-defined coupling sites, are advantageous. In this work, new strategies were developed to generate spatially well-defined, selectively addressable CP domains on a single TMV-like nanotube. To this end, dynamic DNA nanotechnology was applied to drive RNA-mediated self-assembly of TMV CP. The established "stop-and-go technique" uses DNA oligonucleotides as "stoppers" that hybridize sequence-specifically at predefined sites in the TMV RNA, blocking its packaging into TMV CP at the hybrid duplex position. A non-binding overhang ("toehold") allows subsequent restart of assembly using a fully reverse-complementary "release" DNA oligonucleotide (as "fuel"), so that an adjacent CP domain with different binding sites can grow after displacing the stopper strand and replacement of the first CP variant by a second one. With this method, for the first time, differently substructured TMV CP exposing three-domain TLPs were investigated for spatially defined assembly of biomolecules on the nano- to mesoscale, with a view to applications as artificial multienzyme complexes or in multiplex biosensors. Additionally, software-based simulations were performed and pave the way towards precise prediction of accessible RNA sequences for binding DNA blocking elements.
Open Access
Virale Nanoringe für die Integration in Biohybrid-Systeme
(2016) Altintoprak, Klara; Wege, Christina (apl. Prof. Dr.)
Filtereinheiten mit nanoskopischer Porengröße werden zunehmend für medizinische Anwendungen und analytische Verfahren eingesetzt. DNA-Moleküle lassen sich bereits durch Nanoporen sequenzieren, und auch für schnelle und exakte Analysen niedermolekularer Substanzen bergen sie ein hohes Potential. Besonders schwierig ist es allerdings, nanoporöse Membranen mit Millionen von identischen Poren herzustellen. Hybridmembranen könnten hier einen Ausweg bieten, indem sich selbst organisierende biologische Komponenten als "Porenadapter" in poröse anorganische Festkörpermembranen (solid-state membranes, SSMs) integriert werden. Die biologischen Einheiten definieren dann Durchmesser und physikochemische Eigenschaften der effektiven Poren und damit die Selektivität der Filtermembran. Im Rahmen dieses Promotionsprojekts wurde ein neuer stabiler, aber zugleich auch genetisch und chemisch leicht manipulierbarer Porenadapter aus Pflanzenvirusbausteinen entwickelt und für die Insertion in SSM-Poren erprobt und optimiert. Er ist sowohl an seinem äußeren Rand, als auch im Innenkanal spezifisch funktionalisierbar. Als Ausgangsmaterial diente das pflanzenpathogene Tabakmosaikvirus (TMV), ein Nukleoprotein-Röhrchen, das aus einem einzelsträngige (ss)RNA-Molekül und ca. 2130 Hüllprotein-(coat protein, CP)- Untereinheiten besteht. Sowohl die Länge der Partikel, gesteuert über die RNA- Länge, als auch die Protein-Sequenz des CP sind leicht manipulierbar, weshalb TMV zu einem beliebten multifunktionalen Nanobaustein in Hybridmaterialien avanciert ist. Der neuartige Porenadapter aus TMV-Komponenten wurde speziell an die Insertion in eine SSM mit konisch geformten Poren angepasst, wie sie im Labor von Projektpartnern in Ulm hergestellt wird. Aus einem kurzen RNA-Konstrukt, das über In-vitro-Transkription präpariert wurde, und ca. 68 CPs organisiert sich dieser Adapter selbst als eine vierwindige 10 nm lange Nukleoprotein-Helix, die angesichts ihrer lochscheibenähnlichen Form im Folgenden auch „Disk“ genannt wird. Da die „Disks“ in den SSM-Poren unter leicht alkalischen Bedingungen irreversibel fixierbar sein sollen, wurde ihre Struktur im Bereich von pH 7.2 bis 9.0 untersucht und erwies sich als stabil. Damit waren sie den natürlich vorkommenden ringförmigen RNA- freien TMV-CP-Aggregaten klar überlegen, die innerhalb dieses pH-Regimes oligomerisierten und im alkalischen Milieu zerfielen. Auf Isothiocyanat- funktionalisierten Substraten konnten die RNA-haltigen „Disks“ kovalent immobilisiert werden, sodass alle Voraussetzungen für ihre Integration in SSM-Poren bestanden. Bereits in ersten Kombinationsversuchen ließen sich die „Disks“ mit guter Effizienz in SSM-Porenkanäle inserieren, waren aber in den Poren oft nicht richtig orientiert. Deshalb wurde im zweiten Teil des Projekts ein verfeinertes Adapter-Konstrukt mit einer stark polaren Achse konzipiert, das sich, ausgerichtet in einem elektrischen Feld, in die SSM-Poren einfädeln lässt. Es besteht aus einer Nukleoprotein-„Disk“ mit herausragender freier doppelstängiger (ds)RNA, wodurch es über eine wesentlich höhere negative Ladung als die Porenadapter der ersten Generation verfügt. Dank der spezifischen Interaktion der CPs mit ssRNA konnte ein RNA-Konstrukt, das partiell einzel- und partiell doppelsträngig ist, als Grundgerüst für solche „Disks an der Leine" dienen. In gelelektrophoretischen Analysen zeigten die Produkte tatsächlich eine höhere Mobilität als herkömmliche „Disks“. Ziel ist schließlich eine robuste Hybridmembran, in der biologische Porenadapter irreversibel in die SSM-Kanäle implantiert und Leckströme gering sind. Dies ließe sich durch das Abscheiden von anorganischem Material zwischen SSM-Poreninnenwand und „Disk“-Rand erreichen, wenn die Lücke zwischen beiden Komponenten an der Grenzfläche ortsselektiv versiegelt werden könnte. Dafür sind im letzten Teil der Arbeit „Disks“ mit spezifisch mineralisierbarer Außenfläche entstanden, welche ihre Silikat-Ummantelung aus löslichen anorganischen Vorstufen induzieren. Verschiedene mineralisationsvermittelnde Peptide wurden chemisch an TMV-Partikel gebunden und die SiO2-Abscheidungseffizienzen vergleichend untersucht. Besonders vielversprechend war ein Peptid mit alternierendem Lysin-Aspartat-Motiv, (KD)10C, das auf Grundlage von Literaturdaten entworfen wurde. Es lieferte tatsächlich auch nach Konjugation an „Disk“-Außenflächen ausgezeichnete Ergebnisse: Die so mit Peptiden funktionalisierten „Disks“ bewirkten eine ringförmige Abscheidung von SiO2, was bei unmodifizierten „Disks“ nicht beobachtet wurde. Die neuartigen RNA-stabilisierten und leicht funktionalisierbaren „Disks“ aus TMV- Derivaten sind somit aussichtsreiche biologische Porenadapter zur lipidfreien Insertion in Festkörper-Template. Dank der großen Adaptierbarkeit dieser Nanobausteine könnten davon vielfältige Anwendungen profitieren.