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Open Access
Charakterisierung des Regulators ManR und die Anwendung des Mannose Expressionssystems in Bacillus subtilis
(2013) Wenzel, Marian; Mattes, Ralf (Prof. Dr. rer. nat.)
In dieser Arbeit wurde der Transkriptionsaktivator ManR des Bacillus subtilis Operons für den Mannose-Metabolismus näher charakterisiert. Er besteht aus einer N-terminalen DNA-Bindedomäne, zwei Phosphotransferasesystem (PTS)-Regula-tionsdomänen (PRDs) sowie einer EII_Bgl- und einer EIIA_Fru-ähnlichen Domäne. In Analogie zu anderen PRD-haltigen Regulatoren war eine Steuerung der Aktivität von ManR durch Phosphorylierung wahrscheinlich. Die ortsgerichtete Mutagenese von ManR wurde verwendet, um die Rolle seiner konservierten Aminosäure-Reste als potentielle Phosphorylierungsstellen zu untersuchen. Die Aktivität der ManR-Mutanten wurde in vivo über beta-Galaktosidase-Aktivitätstests sowie in vitro über Gel-mobilityshift Assays nachgewiesen. Für die in vitro Versuche mussten die isolierten ManR-Moleküle zuvor mit den PTS-Komponenten HPr, EI und PEP aktiviert werden. Mutationen in der PRD1 reduzierten die Aktivität von ManR, während Mutationen in der PRD2 diese vollständig aufhoben. Die Cys415Ala-(EIIB_Bgl) und die His570Ala-Mutationen (EIIA_Fru) riefen konstitutive Aktivitäten unterschiedlichen Ausmaßes hervor, wobei letztere den größeren Einfluss hatte. Im Wildtyp und in der Cys415Ala-Mutante verringerte die Anwesenheit der PTS-Transporterdomänen EIIBAMan die DNA-Bindeaktivität von ManR signifikant. Dies war jedoch nicht bei der His570Ala-Mutante der Fall. Durch den Austausch der konservierten Amino-säuren von ManR gegen Aspartat konnte keine Phosphomimikry beobachtet werden. Die unterschiedlichen Expressionsniveaus ausgehend von den ManR-kontrollierten Promotoren von manR (PmanR) und des manPA-yjdF Operons (PmanP) konnten der unterschiedlichen 5’-untranslatierten Region der mRNAs zugeordnet werden. Über DNase I Footprinting Experimente wurden palindromähnliche Sequenzen mit einer Länge von 44 bp als ManR-Bindestellen identifiziert. Des Weiteren wurden die Gleichgewichtsdissoziationskonstanten KD und die Dissoziationsraten kdiss von ManR bezüglich beider Promotorregionen bestimmt. Das Mannose-induzierbare Expressionssystem zur Produktion heterologer Proteine in B. subtilis führt zu relativ hohen Produktausbeuten, benötigt dafür jedoch hohe Mengen des teuren Induktors Mannose. Die Deletion des Gens für die Mannose-6-phosphat-Isomerase manA reduziert zwar den Induktorverbrauch, führt jedoch zur Sensitivität der Zellen gegenüber Mannose. Preisgünstiger, Mannose-haltiger Hefe-extrakt wurde als Induktoralternative getestet, zeigte jedoch nur eine geringe Induktionswirkung. Um die Produktausbeute bei gleichzeitiger Reduzierung der Induktorkosten zu steigern, wurde deshalb ein neuartiges, selbstinduzierendes Expressionssystem mit dem PTS-Transporter negativen Stamm B. subtilis TQ356 (spo0A3 delta_manP::ermC) entwickelt, bei dem Glucose die Induktion durch Katabolit-repression verhindert. Für optimale selbstinduzierende Bedingungen wurde eine Glucose-limitierende Prozessstrategie, nämlich ein Fed-Batch-Prozess, herangezogen: Die Selbstinduktion startet mit dem Beginn des Übergangs von der Batch- in die Zufütterungsphase, an dem Glucose limitierend wird, und bleibt während der gesamten Glucose-limitierten Zufütterungsphase erhalten. Dies führt im Vergleich zum Standardsystem zu einer Steigerung der Produktausbeute um fast das 3-fache. Der für das neue System verwendete, pUB110-basierte eGFP-Expressionsvektor (pMW168.1), der nach dem Rolling-Circle-Mechanismus repliziert, zeigte Instabilität bei der Segregation. Die Verwendung eines Replicons, welches nach dem Theta-Mechanismus repliziert, stabilisierte die Weitergabe an die Tochterzellen. Da mit diesem Replicon allerdings auch eine Reduzierung der Plasmidkopienzahl einher-ging, reduzierte sich entsprechend auch die Ausbeute und Produktivität des selbstinduzierenden Systems mit diesem Vektor. Selbst durch eine Erhöhung der Kopienzahl desselben Vektors wurden nicht die Werte erreicht, die mit pMW168.1 erzielt wurden. Die Anwendung der Alanin-Racemase als metabolischen Selektions-marker funktionierte zwar in Schüttelkolbenexperimenten, jedoch nicht bei der Anwendung in der Hochzelldichtefermentation. Die verwendeten Medien zeigten einen starken Einfluss auf die Expression von eGFP mit diesem System: Die Spurenelemente führten zu einem beschleunigten Wachstum, wodurch die Zellen länger in Glucose-Limitation waren und dement-sprechend mehr eGFP produzieren konnten. Der beobachtete negative Effekt der Casamino Acids auf die eGFP Expression wurde eingehend untersucht, führte jedoch zu keinem eindeutigen Resultat in Bezug auf eine bestimmte Komponente oder bestimmten Regulator.
Open Access
Regulation of mtl operon promoter of Bacillus subtilis: requirements of its use in expression vectors
(2011) Morabbi Heravi, Kambiz; Wenzel, Marian; Altenbuchner, Josef
Several vector systems have been developed to express any gene desired to be studied in Bacillus subtilis. Among them, the transcriptionally regulated promoters involved in carbohydrate utilization are a research priority. Expression systems based on Bacillus promoters for xylose, maltose, and mannose utilization, as well as on the heterologous E. coli lactose promoter, have been successfully constructed. The promoter of the mtlAFD operon for utilization of mannitol is another promising candidate for its use in expression vectors. In this study, we investigated the regulation of the mtl genes in order to identify the elements needed to construct a strong mannitol inducible expression system in B. subtilis. Regulation of the promoters of Bacillus subtilis mtlAFD operon (PmtlA) and mtlR (PmtlR) encoding the activator were investigated by fusion to lacZ. Identification of the PmtlA and PmtlR transcription start sites revealed the sigma A like promoter structures. Also, the operator of PmtlA was determined by shortening, nucleotide exchange, and alignment of PmtlA and PmtlR operator regions. Deletion of the mannitol-specific PTS genes (mtlAF) resulted in PmtlA constitutive expression demonstrating the inhibitory effect of EIICBMtl and EIIAMtl on MtlR in the absence of mannitol. Disruption of mtlD made the cells sensitive to mannitol and glucitol. Both PmtlA and PmtlR were influenced by carbon catabolite repression (CCR). However, a CcpA deficient mutant showed only a slight reduction in PmtlR catabolite repression. Similarly, using PgroE as a constitutive promoter, putative cre sites of PmtlA and PmtlR slightly reduced the promoter activity in the presence of glucose. In contrast, glucose repression of PmtlA and PmtlR was completely abolished in a ptsG deletion mutant and significantly reduced in a MtlR (H342D) mutant.