Browsing by Author "Werner, Markus"

Filter results by typing the first few letters
Now showing 1 - 1 of 1
  • Thumbnail Image
    ItemOpen Access
    Klonierung der D-Carbamoylase aus Arthrobacter crystallopoietes DSM 20117
    (2001) Werner, Markus; Syldatk, Christoph (Prof. Dr.)
    Enantiomerenreiche D-Aminosäuren werden als Vorstufen für die industrierelevante Antibiotikaproduktion verwendet. Die Enzyme, die diese Reaktionen katalysieren werden als D-Hydantoinase und L-Carbamoylase bezeichnet. Ziel der Arbeit war es die molekularbiologischen Rahmenbedingungen zur Produktion der D-Carbamoylase aus Arthrobacter crystallopoietes DSM 20017 zu etablieren. Die Klonierung der in der Literatur als instabil beschriebenen D-Carbamoylase sollte über die Klonierung der D-Hydantoinase erfolgen, die in der direkten Nachbarschaft der D-Carbamoylase vermutet wurde. Nach einer Fermentation wurde die D-Hydantoinase aufgereinigt und aus einem SDS-Gel eluiert. Nach einem tryptischen Verdau und der Auftrennung des Peptidgemisches über präparative HPLC wurden die sequenzierten Peptide zur Ableitung von Primern für eine degenerierte PCR verwendet. Dies führte zur Klonierung des ersten DNA-Abschnittes des D-Hydantoinasegens. Mit Hilfe der inversen PCR wurde weitere Bereiche des hyu-Operons sequenziert: die kompletten Leserahmen einer D-Hydantoinase, D- und L-Carbamolyase sowie die Teilsequenzen einer Permease und eines poteniellen Regulatorproteins. Die D-Carbamoylase wurde bezüglich des Substratspektrums, des Molekulargewichtes, pH- und Temperaturoptimums und der Metallabhängigkeit charakterisiert. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der katalytische Reaktionsmechanismus von bestimmten D- und L-Carbamoylase aufgeklärt. Hierzu wurden qualitative Assays für die Umsetzung verschiedener D,L-Carbamoyl-Phenylalanin-Derivaten etabliert, die an unterschiedlichen Positionen des Moleküls durch andere Atome oder Atomgruppen substituiert waren. Die Ergebnisse zeigen, dass D-Carbamoylasen die Decarbamoylierung durch einen Amidasemechanismus katalysieren, während L-Carbamoylasen eine 'echte' Decarbamoylierung des Substrates bewirken. Basierend auf den unterschiedlichen Umsetzungsdaten konnten für beide Katalysetypen die zugrundeliegenden Reaktionsmechanismen beschrieben werde.