Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.18419/opus-10255
Authors: Klenk, Jan M.
Title: Identifikation und Charakterisierung neuer Biokatalysatoren für die C-H-Oxyfunktionalisierung
Other Titles: Identification and characterization of novel biocatalysts for C-H-oxyfunctionalization
Issue Date: 2018
metadata.ubs.publikation.typ: Dissertation
metadata.ubs.publikation.seiten: X, 274
URI: http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/10272
http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-ds-102723
http://dx.doi.org/10.18419/opus-10255
Abstract: Die Enzymklasse der Cytochrom P450 Monooxygenasen stellt in der modernen Biokatalyse eine umweltfreundliche Alternative zu der oftmals unter harschen Reaktionsbedingungen und mit limitierter Selektivität ablaufenden chemischen Synthese dar. Weiterhin sind P450s in der Lage, auch nicht-aktivierte Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindungen selektiv zu oxyfunktionalisieren und somit synthetische Methoden zu komplementieren sowie wertvolle natürliche Produkte unter milden Reaktionsbedingungen zu generieren. Bei dieser Enzymklasse handelt es sich um ubiquitär vorkommende, promiskuitive, hoch diverse und hoch evolvierbare Biokatalysatoren. Trotz vielseitiger Anwendungsmöglichkeiten und der einzigartigen katalytischen Eigenschaften von P450s ist aufgrund der Komplexität des Multikomponentensystems allerdings eine schrittweise Verbesserung für eine industrielle Anwendung unabdingbar, die sich verhältnismäßig aufwändig gestaltet. Die Etablierung neuer P450 Biokatalysatoren zur Generierung wertvoller oxyfunktionalisierter Medikamentenmetaboliten sowie für die Duft- und Aromastoffindustrie interessante Produkte waren Ziele der vorliegenden Dissertation. Die Natur hält in der hoch diversen P450-Superfamilie ein enormes Repertoire potenzieller Biokatalysatoren für spezifische Anwendungen bereit, jedoch ist mit bislang etwa 5000 charakterisierten P450s nur ein geringer Teil der rapide wachsenden Anzahl annotierter Sequenzen (> 38000) untersucht worden. Für die Implementierung in industrielle Prozesse sind letztendlich P450-Ganzzellbiokatalysatoren aufgrund ihrer Cofaktorabhängigkeit obligat. Der Transfer der komplexen P450-basierten Prozesse in den Bioreaktormaßstab mit dem Ziel, leistungsfähige Katalysatoren unter prozessrelevanten Bedingungen zu etablieren, wurde bis dato erst sehr selten durchgeführt. Für einen solchen Ansatz wurde in einem ersten Teil dieser Arbeit die Möglichkeit zur effizienten Herstellung von oxyfunktionalisierten Medikamentenmetaboliten untersucht, deren Bereitstellung essenziell für toxikologische und ökologische Studien ist. Als Biokatalysator wurde das natürliche Fusionskonstrukt P450 RhF aus Rhodococcus sp. eingesetzt. In vorhergehenden Arbeiten konnte festgestellt werden, dass P450 RhF das nicht-steroidale Antirheumatikum (NSAID) Diclofenac unter NADPH-Verbrauch selektiv zu 5-Hydroxydiclofenac funktionalisieren kann. Dieses Enzymsystem wurde in den Bioreaktormaßstab transferiert, wobei hohe und reproduzierbare Expressionen und Produkttiter von bis zu 0,58 g L-1 erzielt werden konnten. Die Aktivität variierte dabei stark zwischen ruhenden und wachsenden Zellen. Eine Ursache hierfür stellt vermutlich die Limitierung der NADPH-Verfügbarkeit in den E. coli Zellen in Abhängigkeit vom Zellstatus dar. Darüber hinaus wurde ein weiterer Metabolit (Quinonimin) detektiert, dessen Bildung nicht-enzymatisch in Abhängigkeit von der Salzkonzentration sowie der Temperatur katalysiert wird. Die oxyfunktionalisierten Medikamentenmetaboliten sind chemisch oftmals schwer zugänglich und besitzen deshalb, ihre Verfügbarkeit vorausgesetzt, einen hohen Marktwert von mehreren hundert Euro pro mg, weshalb in dieser Arbeit neben P450 RhF an einer Plattform unterschiedlicher Katalysatoren für NSAID Hydroxylierungen gearbeitet wurde. Mit den filamentösen Pilzen Beauveria bassiana, Clitocybe nebularis und Mucor hiemalis gelang es, unterschiedliche Diclofenacmetabolite bei einer Substratkonzentration von 0,6 g L-1 in isolierten Ausbeuten über 50% in einem einfachen und günstigen Verfahren herzustellen. Darüber hinaus konnte eine bisher nicht bekannte Verbindung 3’,4’-Dihydroxydiclofenac synthetisiert werden. Auch von weiteren NSAID-Medikamenten wie Ibuprofen, Naproxen oder Mefenaminsäure wurden hohe isolierte Ausbeuten von über 99% (1 g L-1 Substrat) der hydroxylierten Metabolite erhalten; diese Ausbeuten respektive Produkttiter übertreffen bisherige Verfahren mit Mikroorganismen und heterolog exprimierten P450s um über 250%. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der Identifizierung neuer Biokatalysatoren für die Oxyfunktionalisierung komplexer und sperriger Terpene, die bislang nur unzureichend biokatalytisch oder chemisch zugänglich sind. Hierbei sollten P450 Enzyme letztlich in Terpene produzierenden E. coli Ganzzellsystemen den letzten Schritt in der Biosynthese zu wertvollen Terpenoiden katalysieren. Unterschiedliche Strategien wurden zu diesem Zweck verfolgt: I) Untersuchung promiskuitiver Aktivitäten von P450s, II) Anpassung der P450s durch rationale Mutagenese, III) Suche nach neuen P450s aus Terpene metabolisierenden Organismen und IV) Suche nach homologen zu Terpene hydroxylierenden P450s. In einem ersten Ansatz wurden mit bereits charakterisierten P450-Fusionsproteinen zunächst keine promiskuitiven Aktivitäten gegenüber den Terpenen festgestellt. Aus diesem Grund wurde angestrebt, das bakterielle natürliche Fusionskonstrukt CYP116B3 aus Rhodococcus ruber dergestalt zu verändern, das breite Substratspektrum des Enzyms auf ausgewählte Terpene auszuweiten. Dies war jedoch nicht erfolgreich, weshalb als weitere Strategie nach neuen P450s in Terpen-metabolisierenden Organismen gesucht wurde. In Biotransformationen mit B. bassiana wurden erste hydroxylierte Terpene festgestellt, die auf eine Funktionalisierung durch P450s hinweisen. Durch eine Proteomanalyse konnte die Anzahl von 83 potenziellen P450s in B. bassiana pro Substrat auf ein bis vier vermutlich verantwortliche P450s reduziert werden. Allerdings misslang die funktionale heterologe Expression der eukaryotischen Gene in E. coli. Auf der Suche nach neuen P450s wurde weiterhin ein interessanter Papaverin abbauender Organismus, das gram-positive Bakterium Arthrobacter sp., getestet, das auf einigen Terpenen als alleinige C-Quelle wachsen konnte. Da die Hydroxylierung durch P450s häufig den ersten Schritt im Metabolismus von beispielsweise xenobiotischen Verbindungen darstellt, wurde Arthrobacter sp. mittels Proteomanalyse auf die verantwortlichen Enzyme hin untersucht. Die Auswertung führte zur Identifikation eines potenziellen Clusters aus zwei P450s mit den putativen elektronenliefernden Redoxpartnern, die mit dem Papaverinabbau in Verbindung gebracht werden konnten. Hinsichtlich der Terpene wurden dagegen keine Hinweise erhalten. Mit Hilfe von physiologischen oder heterologen Redoxpartnern konnte mit drei P450s aus Arthrobacter sp. eine Aktivität rekonstituiert werden, die eine weitere Charakterisierung der entsprechenden Enzyme ermöglichte. Ähnlich zu anderen Mitgliedern der CYP199A Familie akzeptierte CYP199A25 bevorzugt Benzoesäuren als Substrat, die regioselektiv in para-Position demethyliert oder hydroxyliert wurden. Bei den anderen P450s aus Arthrobacter sp. handelt es sich um Enzyme aus P450-Familien mit bislang noch unbekannter Funktion. Durch die Proteomanalyse sowie den postulierten Papaverinmetabolismus wurden Hinweise auf mögliche Phenylessigsäuren als Substrate erhalten, die experimentell bestätigt werden konnten. Die P450s CYP1232A24 sowie CYP1232F1 katalysieren im Papaverinmetabolismus die zweifache Demethylierung der 3,4-Dimethoxyphenylessigsäure zur 3,4-Dihydroxyphenylessigsäure und weisen hierbei unterschiedliche Selektivitäten für die meta- und para-Position auf. Interessanterweise konnten Elektronen von den im Cluster befindlichen Redoxpartnern, eine Ferredoxin-Reduktase und ein Flavodoxin, effizient transferiert werden, was einem ersten funktionalen physiologischen P450-Klasse III System entspricht. Neben der detaillierten Charakterisierung der Substratspektren wurden Kopplungseffizienzen und kinetische Parameter der drei Enzyme untersucht sowie hoch aktive Ganzzellbiokatalysatoren entwickelt, die bis zu 1,77 g L-1 demethyliertes Produkt bildeten. Bis auf eine Aktivität von CYP1232A24 gegenüber β-Ionon in allylischer Position wurden alle getesteten Terpene jedoch nicht umgesetzt, weshalb ein bislang nicht charakterisiertes Panel aus natürlichen Fusionskonstrukten auf promiskuitive Aktivitäten hin getestet wurde. Das Substratspektrum eines Enzyms mit geringen initialen Aktivitäten gegenüber β-Ionon sowie Valencen wurde schließlich durch rationales Enzymdesign erweitert, was die Oxyfunktionalisierung einiger der ausgewählten Sesquiterpene ermöglichte. Eingesetzt in einen α-Humulen-produzierenden E. coli Stamm eines Kooperationspartners konnten durch die ITB1693 Variante F95A selektiv etwa 300 mg L-1 α-Humulen-6,7-epoxid in situ hergestellt werden. Darüber hinaus wurden auf Grundlage einer Homologiesuche zu Terpen-Hydroxylasen fünf P450s aus dem Myxobakterium Chondromyces apiculatus isoliert, wovon zwei näher charakterisiert werden konnten. Beide Enzyme sind in der Lage, eine große Bandbreite an Substraten zu akzeptieren, wobei im Iononring des β-Ionons auch nicht-allylische Positionen funktionalisiert wurden. Durch eine fokussierte Mutantenbibliothek von CYP109Q5 konnte die Selektivität weiter zu den nicht-allylischen Positionen hin verschoben und zum ersten Mal die für die Carotenoidsynthese bedeutenden und seltenen Produkte 2- und 3-Hydroxy-β-ionon simultan synthetisiert werden. Mit CYP109Q5 gelang es zudem, die komplexen Sesquiterpene umzusetzen, wobei einzelne Varianten eine zum Teil enorme Steigerung der Aktivität und Verschiebung der Selektivität aufwiesen. Ein effizientes Ganzzellsystem erlaubte schließlich die Identifizierung von Produkten ausgewählter Biotransformationen. Mit Hilfe der aktivsten Variante V80A/A280I und der Verwendung des Lösungsmittelvermittlers Cyclodextrin wurden die Hauptprodukte Longifolenaldehyd und Solavetivol synthetisiert. Letzteres dient unter anderem als Vorstufe des Solavetivons, einem wertvollen Phytoalexin. Insgesamt erwies sich CYP109Q5 als hoch evolvierbar und effizient. Die Studien dieser Arbeit zeigen, dass durch rationale Mutagenese aus dem hoch versatilen CYP109Q5-Generalisten mit einem enormen Substratspektrum (Terpene, Steroide und NSAIDs) schrittweise ein industriell wertvoller Spezialist zur Synthese spezifischer Produkte entwickelt werden kann.
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