Mechanismus der Katabolitdegradation der Fructose-1,6-bisphosphatase: die Funktion des Hsp70 Chaperons Ssa1 und weiterer Komponenten

Abstract

Glucose ist ein wichtiger Nährstoff für die Hefe Saccharomyces cerevisiae. Sie wird über die Glykolyse in Energie und zelluläre Bausteine umgesetzt. Gleichzeitig ist Glucose ein Signalmolekül. Steht den Zellen keine Glucose zur Verfügung, so wird diese über die Gluconeogenese synthetisiert. Glykolyse und Gluconeogenese sind antagonistische Stoffwechselwege. Sie werden reziprok reguliert, um u.a. die Verschwendung von ATP durch gleichzeitig stattfindende, gegenläufige Prozesse zu vermeiden. Eines der Schlüsselenzyme der Gluconeogenese ist die Fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase), die bei Wachstum der Zellen auf nicht-fermentierbaren Kohlenstoffquellen, wie beispielsweise Ethanol, exprimiert wird. Nach dem Überführen der Zellen in glucosehaltiges Medium wird FBPase nicht mehr benötigt, sie wird inaktiviert und abgebaut. Die sogenannte Katabolitinaktivierung der FBPase beinhaltet die Repression des FBP1 Gens, die reversible Phosphorylierung am Serinrest 11 der FBPase, die zur Reduktion der Enzymaktivität führt sowie die allosterische Inhibition durch Fructose-2,6-bisphosphat und AMP. Auf die Katabolitinaktivierung folgt die Degradation des Enzyms. In einem genomweiten Screen und früheren Studien wurden insgesamt 9 GID (engl. "glucose induced degradation deficient") Gene identifiziert, deren Deletion zur Stabilisierung der FBPase nach Überführen von ethanol- zu glucosehaltigem Medium führt. Die Proteine werden als Gid1 bis Gid9 bezeichnet. Sechs der neun Gid-Proteine bilden den sogenannten Gid-Komplex, eine E3 Ligase. Er ist unter glykolytischen wie auch gluconeogenetischen Bedingungen aus den Untereinheiten Gid1/Vid30, Gid2, Gid5/Vid28, Gid7, Gid8 und Gid9 aufgebaut. Nach Glucosegabe zu Zellen, die unter gluconeogenetischen Bedingungen gewachsen sind, wird das Protein Gid4/Vid24 exprimiert. Es wird Teil des Komplexes und initiiert die Polyubiquitinierung und damit den Abbau der FBPase. Gid2 enthält eine degenerierte RING-Finger-Domäne, die für die Ligaseaktivität des Komplexes notwendig ist. Mit Hilfe der Enzymkaskade E1 (Uba1), E2 (Gid3/Ubc8) und E3 (Gid-Komplex) wird FBPase polyubiquitiniert und dann über das 26S-Proteasom abgebaut. Zur selektiven Detektion der FBPase wurde ein spezifischer Antikörper gewonnen, der dann in den folgenden Experimenten zum Nachweis der FBPase eingesetzt werden konnte. Bei den Studien zum Gid-Komplex wurde die Rolle von Gid7 näher untersucht, da dieses Protein sechs WD40-Domänen (Protein-Protein-Interaktionsdomänen) enthält und eine zentrale Komponente sein könnte, die den Gid-Komplex zusammenhält. Mit Hilfe von Glycerindichte-gradientenzentrifugations-Experimenten zeigte sich, dass die Deletion von GID7 nicht zum Zerfall des Gid-Komplexes führt, Gid7 muss eine andere Rolle spielen. Eine direkte Beteiligung des Gid-Komplexes am Abbau der FBPase konnte mit Co-Immuno-präzipitationsexperimenten (Co-IP) zwischen FBPase und Gid1-HA3 gezeigt werden. Durch Co-IPs in gid7Δ und gid8Δ Stämmen zeigte sich, dass Gid7 bzw. Gid8 nicht die direkten Interaktionspartner von FBPase im Gid-Komplex sind. Um weitere Interaktionspartner von FBPase zu identifizieren und den Abbau des Enzyms besser zu verstehen, wurden Proteinreinigungen mit FBPase-TAP durchgeführt. Hierbei wurde das Hsp70 Chaperon Ssa1 als neuer Interaktionspartner unter gluconeogenetischen Bedingungen wie auch nach Glucosegabe identifiziert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Ssa1 für die Polyubiquitinierung und den daraufhin induzierten Abbau der FBPase essentiell ist. Ssa1 wird nicht dafür benötigt, FBPase löslich zu halten. FBPase interagiert immer mit Ssa1, wobei Ssa1 die Interaktion von FBPase zur E3 Ligase, dem Gid-Komplex, vermittelt. Im Stamm ssa1-45ts ist Ssa1 unter restriktiven Bedingungen (37 °C) inaktiv; dadurch ist nach Glucosegabe die Interaktion von FBPase zur E3 Ligase gestört und somit keine Polyubiquitinierung von FBPase mehr möglich. Untersucht man die Situation von der Gid-Komplex Seite aus, dann interagieren Ssa-Proteine unter gluconeogenetischen Bedingungen und wahrscheinlich auch nach Glucosegabe mit dem Gid-Komplex. Ssa1 ist nicht nur am Abbau von FBPase, sondern auch am Abbau von PEPCK, einem weiteren Schlüsselenzym der Gluconeogenese, beteiligt. Für die ATPase-Funktion von Hsp70 Chaperonen werden Co-Faktoren benötigt. Hier konnte die Beteiligung des NEFs (engl. „nucleotide exchange factor“) Snl1 am katabolitinduzierten Abbau der FBPase gezeigt werden. Weitere untersuchte Faktoren haben keinen Einfluss.

Glucose is the main carbon source of many cells. Its consumption via glycolysis provides energy and generates building blocks for the cellular metabolism. Apart from that glucose acts as a signal molecule. When glucose is lacking, cells are able to regenerate this sugar via gluconeogenesis. Glycolysis and gluconeogenesis are antagonistic pathways and they are reciprocally controlled to prevent an ongoing futile cycle of ATP hydrolysis. One of the key enzymes of gluconeogenesis is fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase). FBPase is expressed when cells grow on a non-fermentable carbon source like ethanol. After addition of glucose FBPase synthesis is repressed, the enzyme is rapidly inactivated, polyubiquitinated and degraded. The so-called catabolite inactivation of FBPase encompasses repression of the FBP1 gene, decrease of the enzyme activity upon phosphorylation at serine residue 11 and allosteric inhibition by fructose-2,6-bisphosphate and AMP. Subsequently, FBPase undergoes rapid degradation. In a genome-wide screen and in some earlier studies nine GID (glucose induced degradation deficient) genes were identified. Deletion of these genes leads to stabilization of FBPase upon shift to glucose. Under gluconeogenic conditions six Gid proteins (Gid1/Vid30, Gid2, Gid5/Vid28, Gid7, Gid8 and Gid9) form a complex which represents a ubiquitin ligase. Gid2 contains a degenerated RING finger domain and bears ligase activity. Upon glucose addition to gluconeogenic cells a seventh subunit Gid4/Vid24 occurs and initiates FBPase polyubiquitination and its subsequent elimination by the proteasome. Polyubiquitination of FBPase takes place by the classical enzyme cascade E1 (Uba1), E2 (Gid3/Ubc8) and E3 (Gid complex). In this work a specific FBPase antibody was obtained which was used for immunoprecipitation and immunodetection of FBPase. The role of Gid7 was analyzed because it contains six WD40 domains (protein protein interaction domains) and was expected to be a central component of the Gid complex. Glycerol density gradient fractionation under gluconeogenic conditions revealed that deletion of GID7 did not result in breakdown of the complex. Gid7 must play another role. An involvement of the Gid complex in the degradation of FBPase was shown by co-immunoprecipitation (Co-IP) experiments between FBPase and Gid proteins. Co-IPs in gid7Δ and gid8Δ strains showed that Gid7 and Gid8 are not direct interaction partners of FBPase in the Gid complex. To understand the degradation of FBPase in more detail protein purification using a FBPase-TAP fusion protein was performed under gluconeogenic conditions and after shift to glucose-containing medium. Mass spectrometry analysis identified the Hsp70 chaperone Ssa1 as a novel interaction partner of FBPase under both conditions. Ssa1 is crucial for polyubiquitination and degradation of FBPase. Ssa1 is not necessary for keeping FBPase in a soluble state. Ssa1 and even inactive Ssa1-45 proteins are stable interaction partners of FBPase. Ssa1 mediates the interaction of FBPase to the Gid complex, the E3 ligase. In ssa1-45ts cells under restrictive conditions (37 °C) FBPase loses contact to its E3 after shift to glucose-containing medium. Therefore polyubiquitination of FBPase is no longer possible. Additionally a pull-down of the Gid complex showed that Ssa proteins interact with this complex under gluconeogenic conditions and probably after shift to glucose-containing medium. Furthermore Ssa1 is also involved in degradation of PEPCK, another key regulatory enzyme of gluconeogenesis. The specificity and activity of Hsp70 chaperones is often regulated by co-factors. Several Ssa1 co-chaperones were tested but it seems that only the NEF (nucleotide exchange factor) Snl1 is involved in degradation of FBPase.