ER-assoziierte Proteindegradation (ERAD): Untersuchungen von Komponenten zum Abbau glykosylierter und unglykosylierter Substrate

Abstract

Die Funktion von Proteinen hängt von ihrer korrekten Struktur ab. In eukaryontischen Zellen existieren deshalb Protein Qualitätskontrollsysteme, die missgefaltete Proteine erkennen und abbauen können. Für neusynthetisierte sekretorische Proteine befindet sich eine solche Qualitätskontrolle im endoplasmatischen Retikulum (ER) und wird allgemein als ER-abhängige Protein Qualitätskontrolle (ERQC) bezeichnet. Missgefaltete Proteine werden im ER über einen retrograden Transport zurück ins Zytosol transportiert und dort über das Ubiquitin-Proteasom-System abgebaut. Man nennt diesen ERQC-abhängigen Abbau von Proteinen die ER-assoziierte Degradation (ERAD). Diese Systeme sind evolutionär hoch konserviert. Man findet sie in allen Eukaryontenzellen von der Hefe bis zum Menschen. Ein für proteinbiochemische und molekularbiologische Methoden leicht zugänglicher eukaryoter Modellorganismus ist die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae. Mehrere Studien mit dem ERAD-Modellsubstrat CPY* zeigten die Bedeutung der Glykane an Proteinen für die ER-assoziierte Degradation von missgefalteten glykosylierten sekretorischen Proteinen auf. In Wildtypzellen wird glycosyliertes CPY* mit einer Halbwertszeit von t1/2 = 20 min abgebaut; die entsprechend unglykosylierte Variante CPY*0000 wird stabilisiert mit einer Halbwertszeit von ca. t1/2 = 90 min. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die zwar verlangsamte Degradation von CPY*0000 noch eine von Schlüsselkomponenten des ERAD abhängige Degradation ist. Zunächst wurde in mehreren unabhängigen Pulse-Chase Analysen eine Stabilisierung von CPY*0000 in einem pre1-1 pre4-1 Stamm gefunden. Eine Stabilisierung von CPY*0000 wurde in weiteren Pulse-Chase Analysen mit einem delta-der3-Stamm entdeckt, der die für ERAD-L und -M Weg notwendige E3-Ubiquitin-Ligase Der3 depletiert. Zudem wurde in einer Pulse-Chase Analyse das Abbauverhalten von CPY*0000 in vakuolären Proteinasen defizientem Zellen untersucht. Die beiden ER lumenalen Proteine Yos9 und Htm1 (auch Mnl1 genannt) wurden auf Grund von ersten Studien als Lektine vermutet, die den Glykan-Status an glykosylierten sekretorischen Proteinen detektieren können. In dieser Arbeit wurden in vivo Bindungspartner von Yos9 nachgewiesen. In Immunopräzipitationsexperimenten wurden Bindungen von Yos9 zu seinem Substrat CPY* und zu ERAD Komponenten Cdc48, Der3, Htm1 und Kar2 gefunden. Die Bindungen von Yos9 zu Cdc48 und Der3 sind Hrd3 abhängig, nicht aber die Bindung zum Substrat, wie weitere Immunopräzipitationen zeigten. In weiteren Co-Immunopräzipitationen wurde auch eine Bindung von Htm1 zu der ER-α1,2-Mannosidase (Mns1) ausgeschlossen. Htm1 besitzt eine zu Mns1 homologe Mannosidase-Domäne. In dieser Arbeit wurden deshalb genetische Analysen mit Htm1 und Mns1 durchgeführt. Erstmals konnte ein genetischer Zusammenhang zwischen den beiden Genen gefunden werden: Die Gene MNS1 und HTM1 haben auf die Degradation von CPY* einen additiven Effekt. Mit verschiedenen Deletionstämmen wurden Pulse-Chase Analysen im Hinblick auf die Degradation CPY* durchgeführt. Zellen mit eine Deletion in den Genen MNS1 oder Htm1 zeigten jeweils nur noch eine Degradation von CPY* mit einer Halbwertszeit von ca. t1/2 = 90 min auf. Eine delta-mns1 delta-htm1 Doppeldeletion in den Zellen führte darüber hinaus zu einer fast vollständigen Stabilisierung von CPY*. Der delta-mns1 delta-htm1 Doppeldeletionsstamm wurde mit einem „high-copy“ Plasmid transformiert, das Htm1 kodierte. In Pulse-Chase Analysen wurde nun gezeigt, dass diese Überexpression von Htm1 in den Zellen den delta-mns1 Phänotyp hinsichtlich der CPY* Degradation nicht ändert. Analog wurde dieses Experiment mit überexprimierter Mns1 im delta-htm1 Deletionsstamm durchgeführt und nachgewiesen, dass auch eine Überexpression von Mns1 nicht den delta-htm1 Phänotyp ändert. Die Funktion von Usa1 im ERAD ist in Hinblick auf seine Substratspezifität widersprüchlich. Im Rahmen einer Kooperation mit der Gruppe von T. Sommer, MDC Berlin, wurde in dieser Arbeit der Abbau von CTG* in DF5-Stämmen in Abhängigkeit von USA1 untersucht. Es wurden der DF5-Stamm Wildtyp für USA1 und der DF5-Stamm delta-usa1 mit einer USA1 Deletion mit dem Plasmid, welches CTG* kodiert, transformiert. Mit den Transformanden wurden zwei unabhängige Pulse-Chase-Analysen durchgeführt. In beiden Versuchen zeigte sich eine deutliche verlangsamte Degradation von CTG* in den delta-usa1-Zellen im Vergleich zu den USA1-Wildtypzellen.

The function of proteins depends on their correct structure. Therefore, there are protein quality control systems in eukaryotic cells which can recognize and destroy misfolded proteins. For newly synthesized secretory proteins, such a quality control system resides within the endoplasmic reticulum and is called ER-assoiciated quality control system (ERQC). Misfolded proteins in the ER are translocated via retrograde transport back to the cytosol and are degraded there by the ubiquitin-proteasome system. This ERQC-dependend degradation of proteins is called ER-associated degradation (ERAD). Both systems are highly evolutionarily conserved. They are found in all eukaryotic cells from yeast to human. One for protein biochemistry and molecular biological methods easily accessible eukaryotic model organism is the baker's yeast Saccharomyces cerevisiae. Several studies with the ERAD model substrate CPY* demonstrated the relevance of glycans on proteins for the ER-associated degradation of misfolded glycosylated secretory proteins. In wild-type cells glycosylated CPY* is degraded with a half-life of t1/2 = 20 min; the corresponding to CPY* non-glycosylated variant CPY*0000 is stabilized to a half-life of about t1/2 = 90 min. In this study it was shown for the first time that the although slowed down degradation of CPY*0000 is still a degradation which depends on key components of ERAD. First, in several independent pulse-chase analysis in a pre1-1 pre4-1 strain CPY*0000 was found to be stabilized. A stabilization of CPY*0000 was discovered in further pulse-chase analysis with a delta-der3 strain which lacks the necessary E3 ubiquitin ligase Der3 of the ERAD-L and -M way. In addition, a pulse-chase analysis of the degradation behavior of CPY*0000 vacuolar proteases deficient cells were investigated. The ER luminal proteins Yos9 and Htm1 (also known as Mnl1) were based on initial studies suspected to be lectines, which can detect the status of the glycan of a glycosylated secretory protein. The glycans on a glycoprotein act as a stabilization signal in the secretory pathway. In this work, it was possible to find in vivo binding partners of Yos9. In immune precipitations, it was shown that Yos9 binds to its substrate CPY* and to ERAD components Cdc48, Der3, Htm1, and Kar2. The bindings of Yos9 to Cdc48 and Der3 are depending on Hrd3. But the binding of Yos9 to its substrate does not depend on Hrd3. Additional co-immunoprecipitations in this work could exclude that Htm1 and the ER-α1,2-mannosidase (Mns1) bind to each other. Htm1 contains a mannosidase domain homolog to Mns1. Thus, genetical analyses were performed with HTM1 and MNS1 in this work. For the first time, a genetic relationship between the two genes was found: The genes HTM1 and MNS1 have an additive effect on the degradation of CPY*. Several pulse-chase analyses were performed to investigate the degradation of CPY*. Cells with a deletion in one of the genes MNS1 or HTM1 showed a reduced CPY* degradation with a half-life of about t1/2 = 90 min. Furthermore, a delta-mns1 delta-htm1 double deletion strain led to a nearly complete stop of CPY* degradation in vivo. This additive effect was further investigated in this study. The delta-mns1 delta-htm1 strain was transformed with a high-copy vector encoding for HTM1. In the received strain, an over expression of Htm1 could be detected in comparison to a strain which coded for HTM1 on the chromosome. Pulse-chase analysis were performed in which the over expression of Htm1 did not affect the phenotype of delta-mns1 cells in terms of CPY* degradation. The same experiment was performed vice versa with an over expression of Mns1 in a delta-htm1 deletion strain and it could be demonstrated that the over expression of Mns1 did not rescue the delta-htm1 phenotype as well. These results suggest that Htm1 and Mns1 have no redundant function on ER-associated degradation of CPY*. The function of both proteins must vary in spite of the additive effect and the homology of their amino acid sequence. The function of Usa1 in the ERAD is in terms of its substrate specificity contradictory. Within a cooperation with the group of T. Sommer, MDC Berlin, the degradation of CTG* in DF5 strains depending on the gene USA1 was investigated. The DF5 strain wild type in USA1 and the DF5 delta-usa1 strain were transformed with a vector coding for CTG*. Two independent pulse-chase analyses were performed with these transformed strains. Both results showed a clearly reduced degradation of CTG* within the delta-usa1 strain in comparison to the USA1 wild-type strain.