Engineering of bispecific T cell receptors using mammalian display technologies

Abstract

The main goal of immunotherapy in oncology is to use the power of the patient’s own immune system to fight cancer. Therefor many bispecific antibodies were developed mainly for redirecting T cells to cancer cells. A novel and promising class of biotherapeutics are increasingly recognized, namely bispecific T cell receptor (TCR)- based molecules capable of redirecting and activating T cells towards tumor-specific peptides presented by human leucocyte antigens (HLA). The usage of TCR-based molecules allows for targeting of novel tumor antigens including intracellular antigens and thus significantly widens the accessible target space in cancer immunotherapy. In contrast to antibodies, TCRs naturally exhibit a low binding affinity and stability and thus a complex maturation process is required for successful generation of TCR-based biotherapeutics. We developed a Chinese hamster ovary (CHO) cell display system for the maturation of TCR-based biomolecules, such as T cell engaging receptor (TCER®). Unlike previously used phage or yeast display systems, the mammalian system is capable of engineering TCRs in the final TCER® format making the step of reformatting of matured TCRs dispensable. The display approach is based on a recombinase-mediated cassette exchange for efficient and stable single copy integration of bispecific agents into a predefined genetic locus of the CHO cell. This work describes the setup of the CHO display, the membrane-bound expression of different TCR-based formats as well as its successful application for engineering of TCER® molecules using TCR variable domains from a model TCR recognizing preferentially expressed antigen in melanoma (PRAME). Affinity-improved TCER® molecules were isolated from a library encoding different complementarity determining region (CDR) variants in the final format. The selected TCER® candidates were evaluated in the CHO display system regarding their binding to the PRAME pHLA target as well as 11 peptides with high degree of sequence similarity to the PRAME peptide as part of specificity testing. TCER® variants expressed as soluble proteins showed strong reactivity against PRAME-positive tumor cells linked with a pronounced cytokine release from activated T cells. This study supports feasibility of the CHO-based maturation system for TCR affinity maturation in the final TCER® format and demonstrate data consistency between membrane-bound and soluble TCER® format.

Das Hauptziel der Immuntherapie in der Onkologie besteht darin, die Kraft des eigenen Immunsystems des Patienten zur Krebsbekämpfung zu nutzen. Zu diesem Zweck wurden viele bispezifische Antikörper entwickelt, die vor allem T-Zellen auf Krebszellen umlenken sollen. Eine neue und vielversprechende Klasse von Biotherapeutika wird zunehmend anerkannt, nämlich bispezifische Moleküle auf der Basis von T-Zell- Rezeptoren (TCR), die in der Lage sind, T-Zellen auf tumorspezifische Peptide umzulenken und zu aktivieren, die von menschlichen Leukozytenantigenen (HLA) präsentiert werden. Die Verwendung von TCR-basierten Molekülen ermöglicht die gezielte Ansprache neuartiger Tumorantigene, einschließlich intrazellulärer Antigene, und erweitert damit den für die Krebsimmuntherapie zugänglichen Zielbereich erheblich. Im Gegensatz zu Antikörpern weisen TCRs von Natur aus eine geringe Bindungsaffinität und -stabilität auf, so dass für die erfolgreiche Herstellung von TCR- basierten Biotherapeutika ein komplexer Maturierungsprozess erforderlich ist. Wir haben ein CHO-Zell-Display-System für die Maturierung von TCR-basierten Biomolekülen, wie z. B. dem T cell engaging receptor (TCER®), entwickelt. Im Gegensatz zu den bisher verwendeten Phagen- oder Hefe-Display-Systemen ist das Säugetiersystem in der Lage, TCRs im endgültigen TCER®-Format zu präsentieren, so dass der Schritt der Neuformatierung von gereiften TCRs überflüssig ist. Der Display- Ansatz basiert auf einem Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch zur effizienten und stabilen Integration von bispezifischen Molekülen in einen vordefinierten genetischen Lokus der CHO-Zelle in einer einzigen Kopie. Diese Arbeit beschreibt den Aufbau des CHO-Displays, die membrangebundene Expression verschiedener TCR- basierter Formate sowie die erfolgreiche Anwendung für das Engineering von TCER®- Molekülen unter Verwendung variabler TCR-Domänen eines Modell-TCRs, der ein preferentially expressed antigen in melanoma (PRAME) Peptid erkennt. TCER®- Moleküle mit verbesserter Affinität wurden aus einer Bibliothek isoliert, die für verschiedene Varianten der komplementäritätsbestimmenden Region (CDR) im endgültigen Format kodiert. Die ausgewählten TCER®-Kandidaten wurden im CHO- Display-System auf ihre Bindung an das PRAME pHLA Target sowie an 11 Peptide mit hoher Sequenzähnlichkeit zum PRAME Peptid im Rahmen von Spezifitätstests untersucht. TCER®-Varianten, die als lösliche Proteine exprimiert wurden, zeigten eine starke Reaktivität gegen PRAME-positive Tumorzellen, verbunden mit einer ausgeprägten Zytokinfreisetzung von aktivierten T-Zellen. Diese Studie unterstützt die Möglichkeit des CHO-basierten Maturierungssystems für die TCR-Affinitätsreifung im endgültigen TCER®-Format und demonstriert die Datenkonsistenz zwischen membrangebundenem und löslichem TCER®-Format.