Development of acetylcholinesterase biosensors for neurotoxins detection in foods and the environment

Abstract

Acetylcholinesterase (AChE) is responsible for the hydrolysis of acetylcholine in the nervous system. It is inhibited by several substances, like organophosphate and carbamate insecticides, glycoalkaloids, nerve gas and anatoxin-a(s). There is a growing need to develop new technologies to reduce time spent with sample preparation, discriminate between positive and negative samples, and to reduce analysis costs. Over the last decades, AChE biosensors have emerged as an ultra sensitive and rapid technique for toxicity analysis in environmental monitoring, food and quality control. Acetylcholinesterase is only slightly inhibited by organophosphorothionate insecticides, the most applied organophosphate insecticides worldwide. This fact makes their detection analytically very difficult. A new enzymatic method for the activation and detection of phosphorothionates was developed with the capability to be used directly in food samples without the need of laborious solvent extraction steps. Chloroperoxidase (CPO) from Caldariomyces fumago was combined with tert-butyl hydroperoxide and two halides. Chlorpyrifos and triazophos were completely oxidized. Fenitrothion, methidathion and parathion methyl showed conversion rates between 54 – 61%. Furthermore, the oxidized solution was tested with an AChE biosensor assay. Chlorpyrifos spiked in organic orange juice was oxidized, and its oxon product was detected in concentrations down to 5 µg/L (final concentration food sample: 25 µg/L). The complete duration of the method took about 2 h. An acetylcholinesterase B multisensor from Nippostrongylus brasiliensis (Nb) was developed to detect the most frequently used insecticides in Brazil. The objective was to establish a fast screening method, separating the negative samples from the positive ones. The four mutants, which together presented the widest sensitivity spectrum, were: F345A, M301A, W346V and W346A. The combination of these four mutants in a multienzyme biosensor array enabled the detection of 11 out of the 12 most important insecticides at concentrations below 20 µg/L. The biosensor test was compared with traditional analysis methods, and validated with food samples previously analyzed. The storage stability revealed that the biosensor remained stable for 40 weeks; however the sensitivity decreased with time. Glycoalkaloids are secondary metabolites present in potatoes, which can be toxic to humans in high concentrations. Alfa-Solanine and alfa-chaconine are the main examples of this group, and these substances show an anti-acetylcholinesterase activity. An Nb acetylcholinesterase B biosensor was designed to detect glycoalkaloids in buffer solutions and in foods. The two Nb AChE mutants that showed the highest sensitivity towards alfa-solanine and alfa-chaconine (lowest I50 value) were W303L and F345A. The Dixon and Cornish-Bowden plots demonstrated that the inhibition of these substances over Nb AChE was reversible and competitive. The achieved detection limits of alfa-chaconine and alfa-solanine were 0.1 and 0.5 µM, respectively. The designed biosensor was able to detect mixtures of alfa-solanine and alfa-chaconine in potatoes samples spiked with these glycoalkaloids in total concentrations higher than 300 µM.

Pflanzenschutzmittel werden seit vielen Jahren in der Landwirtschaft in großem Umfang eingesetzt, um Ernteerträge zu steigern. Acetylcholinesterase (AChE), ein zentrales Enzym der Nervenreizleitung, wird durch Organophosphate und Carbamate gehemmt. Durch Hemmung der AChE kommt es im Gehirn an cholinergen Synapsen des autonomen Nervensystems und an motorischen Endplatten zur Anreicherung des Neurotransmitters Acetylcholin (ACh). Diese Pestizide agieren nicht nur auf Insekten-AChE, sondern wechselwirken auch mit AChE anderer Organismen, einschließlich der menschlichen (Fukuto 1990). Für die Routineanalytik von Organophosphaten wird Gaschromatografie mit Massenspektrometrie-Kopplung (GC/MS) eingesetzt. Die thermolabilen Carbamate können nur mittels Flüssigchromatografie mit Massenspektrometrie-Kopplung (LC/MS) nachgewiesen werden. Diese Methoden zeichnen sich durch einen hohen apparativen Aufwand und durch zeitaufwendige Analysen aus. Für den Nachweis von neurotoxischen Substanzen, z.B. Organophosphaten und Carbamaten, wurden, neben einem kommerziellen AChE-Test, eine Reihe von AChE-Biosensoren entwickelt. Die weitaus größte Zahl der AChE-Biosensoren basiert jedoch auf einer amperometrischen Detektion der AChE-Aktivität (Schulze et al. 2002). Das erste Ziel war die Entwicklung einer Vorbehandlungsmethode mit dem Enzym Chloroperoxidase (CPO), um Organophosphorthionate Insektiziden zu aktivieren. Die Aktivierung ist nötig, weil Phosphorthionate in ihrer ursprünglichen, nicht metabolisierten Form, sehr schwache AChE-Inhibitoren sind. Diese Pestizide werden später durch einen AChE-Biosensor näher bestimmt. Es wurde bestimmt, dass CPO eine erfolgreiche Alternative für die Anwendung von AChE-Biosensor sein kann. Die Nachweisgrenze wurde in Lebensmittelproben auf 5 µg/L festgestellt (Endkonzentration in Lebensmittel: 25 µg/L – 20% Bio Orangensaft-Zugabe). Ein weiteres Forschungsziel war die Entwicklung eines AChE-Biosensors maßgeschneidert für Brasilien, der in dem brasilianischen Bundeskontrollprogramm von Pestiziden in Lebensmitteln benutzt werden kann. Das bedeutet, das Biosensor-Verfahren als Screening Test zu benutzen, um die Analysegeschwindigkeit zu beschleunigen. Gegenüber den Pestiziden Fenitrothion, Chlorpyrifos, Triazophos und Methamidophos stellte sich heraus, dass die entsprechenden Nachweisgrenzen des Multienzymsensors gegenüber den vier Pestiziden im Puffer 0.05, 0.025, 0.025 und 10 µg/L ist. Das Gesetz in Brasilien erlaubt in Lebensmitteln generell die Anwesenheit von bis zu 10 µg/L Chlorpyrifos, 50 µg/L Fenitrothion, 10 µg/L Triazophos und 10 µg/L Methamidophos. Das bedeutet, dass der Multienzymsensor geeignet ist, um als screening tool für das brasilianische Bundeskontrollprogramm eingesetzt zu werden. Die dritte Aktivität konzentriertete sich auf die Entwicklung eines AChE Biosensors, um Glykosidalkaloide in Kartoffeln zu entdecken. Die giftigen Glykosidalkaloide Alfa-Solanin und Alfa-Chaconin kommen von Natur aus in kleinen Mengen in Kartoffeln vor - und sind für die Menschen toxisch. Zudem ist bei diesen zwei Substanzen AChE gehemmt. Ein Gesamtalkaloid-Gehalt (Summe von Alfa-Solanin und Alfa-Chaconin) von bis zu 200 mg/kg gilt bei Kartoffeln bislang als unbedenklich. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass die Mutanten W303L und F345A die sensitivsten gegen die getesteten Glykosidalkaloide waren. Es wurde später ein Multienzymsensor bestehend aus diesen zwei verschiedenen Nb AChE Mutanten hergestellt. Kinetik-Untersuchungen wurden durchgeführt, um herzufinden, was für ein Hemmungsmechanismus Nb AChE über Alfa-Solanin und Alfa-Chaconin hat. Die Dixon- und Cornish-Bowden-Plots zeigten, dass diese Glykosidalkaloide Nb AChE reversibel und konkurrenzfähig gehemmt haben. Die Nachweisgrenzen von Alfa-Chaconine und Alfa-Solanine wurden auf 0.1 and 0.5 µM festgelegt.