Components and mechanisms of cytoplasmic protein quality control and elimination of regulatory enzymes

Abstract

Relatively little is known about cytoplasmic protein quality control in eukaryotic cells. After proteins have been translated on ribosomes, they have to achieve their native conformation, get to their place of action and be assembled into protein complexes when indicated. Errors in the protein sequence caused by DNA mutations, mistakes during transcription or translation, as well as folding disorders caused by chemical or physical stress can impair the proper functionality of the cell and evoke diseases. Therefore, it is the task of the cellular protein quality control system to assist proteins while folding into their native conformation, to unfold misfolded proteins and to refold them. Finally, irreversibly misfolded proteins have to be transferred for degradation to the proteolytic systems of the cell, the 26S proteasome or the vacuole (lysosome). The components that are involved in the control of protein folding and in the transfer of misfolded cytoplasmic proteins to the proteolytic systems have been poorly investigated. In this work, novel components of the cytoplasmic quality control system have been discovered by studying mutated variants of carboxypeptidase Y (CPY*), a vacuolar enzyme, which due to deletion of its signal sequence cannot be imported into the endoplasmic reticulum (ER) for further transfer into the vacuole and therefore is permanently located to the cytoplasm of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Studies investigating ∆ssCPY* (signal sequence deleted CPY*), ∆ssCG* (∆ssCPY* carrying a C-terminal GFP tag) and the corresponding wild-type enzyme ∆ssCPY showed that for proteasomal degradation of these substrates the cytoplasmic chaperone Hsp70 (Heat shock protein) Ssa1, the Hsp40 co-chaperone Ydj1 and the ubiquitin-conjugating enzymes (E2) Ubc4 and Ubc5 are necessary. It could be shown that Ssa1 and Ydj1 are involved in the resolubilization of precipitated ∆ssCG*, in keeping ∆ssCG* in solution and in the transport of ubiquitylated ∆ssCG* to the 26S proteasome. The following study searched for further factors of the cytoplasmic quality control, especially a ubiquitin ligase (E3), which is capable of targeting misfolded cytoplasmic proteins for proteasomal degradation. Yeast mutants were isolated in a genetic screen, which are able to stabilize the fusion protein ∆ssCL*myc (∆ssCPY* C-terminally fused to myc-tagged 3-isopropylmalate dehydrogenase (LEU2myc)) and are therefore able to grow on media lacking leucine. This led to the discovery of the E3 Ubr1. Subsequent investigations revealed that the proteasomal degradation of ∆ssCL*myc is strongly dependent on Ubr1 and that the misfolded substrate physically interacts with this E3. Furthermore, it could be shown that for degradation of ∆ssCL*myc and ∆ssCG* the Hsp110s Sse1 and Sse2 are necessary, probably functioning as nucleotide exchange factors for Ssa1. Besides the degradation of finally misfolded cytoplasmic proteins, the eukaryotic cell utilizes its proteolytic systems to eliminate regulatory enzymes upon changes in the cellular environment. After switching cells from non-fermentable to fermentable media, a key regulatory enzyme in the gluconeogenesis pathway, fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase), is ubiquitylated by the Gid-E3 complex and then degraded by the ubiquitin proteasome system (UPS) to allow switching from gluconeogenesis to glycolysis. In a further study we found that for degradation of ubiquitylated FBPase procession by the AAA-ATPase Cdc48 and its co-factors Ufd1 and Npl4 is necessary. This is the first time that for degradation of a native substrate by the UPS a dependency on the Cdc48-Ufd1-Npl4 complex could be shown. In addition, it could be shown that the ubiquitin receptor proteins Dsk2 and Rad23 are also necessary for the proteasomal degradation of FBPase. Before a ubiquitylated substrate of the 26S proteasome is degraded, its ubiquitin chains are cleaved off. The ubiquitin-specific protease Ubp14 cleaves these free chains to single ubiquitin molecules. Cells deleted in UBP14 accumulate ubiquitin chains, which leads to impairment of the UPS dependent protein degradation. In a further study we demonstrated that inhibition of proteasomal degradation by deletion of UBP14 does not occur in the degradation process of all substrates tested. While e.g. UPS dependent degradation of the gluconeogenic enzyme FBPase is impaired in ∆ubp14 strains, degradation of ∆ssCG* is only slightly reduced and degradation of a misfolded substrate of the ER, CPY*HA is not at all affected. This finding suggests that there are several substrate specific pathways to proteasomal degradation, which can be defined by a varying dependency on Ubp14.

Über die Proteinqualitätskontrolle im Zytoplasma von eukaryontischen Zellen ist vergleichsweise wenig bekannt. Nachdem Proteine an den Ribosomen translatiert wurden, müssen sie sich in ihre native Konformation falten und an ihren Wirkungsort gelangen. Fehler in der Proteinsequenz, verursacht durch Mutationen der DNA, Transkriptions- oder Translationsfehler, sowie durch chemischen und physikalischen Stress auftretende Faltungsstörungen der Proteine, können die korrekte Funktionsweise der Zelle stören und Krankheiten hervorrufen. Aufgabe der Proteinqualitätskontrolle der Zelle ist es daher, Proteinen bei der Faltung in ihre natürliche Konformation zu helfen, fehlgefaltete Proteine zu entfalten und wieder von neuem zu falten. Endgültig fehlgefaltete Proteine müssen den proteolytischen Systemen der Zelle, 26S Proteasom oder Vakuole (Lysosom), zum Abbau zugeführt werden. Über die Komponenten, welche im Zytoplasma an der Durchführung und Kontrolle der korrekten Faltung, sowie an der Übergabe an die proteolytischen Systeme beteiligt sind, ist relativ wenig bekannt. Mittels Studien an mutierten Varianten des vakuolären Enzyms Carboxypeptidase Y (CPY*), die aufgrund genetischer Entfernung ihrer Signalsequenzen nicht in das Endoplasmatische Retikulum (ER) zum Weitertransport in die Vakuole importiert werden können, und daher permanent im Zytoplasma der Knospungs-Hefe Saccharomyces cerevisiae verbleiben, wurden neue Komponenten der zytoplasmatischen Qualitätskontrolle entdeckt. Durch Studien an ∆ssCPY* (signalsequenzdeletierte CPY*), ∆ssCG* (∆ssCPY* mit C-terminalem GFP), sowie am entsprechenden Wildtypenzym ∆ssCPY konnte gezeigt werden, dass für den proteasomalen Abbau das zytoplasmatische Hsp70 (Hitzeschockprotein) Ssa1, das Hsp40 Ko-Chaperon Ydj1, sowie die ubiquitin-konjugierenden Enzyme (E2) Ubc4 und Ubc5 notwendig sind. Es konnte gezeigt werden, dass Ssa1 und Ydj1 an der Wiederauflösung von ausgefallenem ∆ssCG*, an dem Prozess es in Lösung zu halten und am Transport von ubiquitinyliertem ∆ssCG* zum 26S Proteasom beteiligt sind. In einer anschließenden Studie wurde nach weiteren Faktoren der zytoplasmatischen Qualitätskontrolle gesucht, insbesondere nach einer Ubiquitinligase (E3), welche in der Lage ist, fehlgefaltete zytoplasmatische Proteine durch spezifische Ubiquitinylierung dem proteasomalen Abbau zu übergeben. Dafür wurden in einem genetischen Screen Hefemutanten isoliert, welche das Fusionsprotein ∆ssCL*myc (∆ssCPY* mit C-terminaler Myc getaggter 3-Isopropylmalatdehydrogenase (LEU2myc)) stabilisieren und dadurch auf Medium ohne Leucin wachsen können. Dabei wurde das E3 Ubr1 gefunden. Durch anschließende Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass der proteasomale Abbau von ∆ssCL*myc stark von Ubr1 abhängig ist, sowie der Befund erhoben werden, dass das fehlgefaltete Substrat mit diesem E3 physikalisch interagiert. Ferner konnte gezeigt werden, dass für den Abbau von ∆ssCL*myc und ∆ssCG* die Hsp110 Proteine Sse1 und Sse2, wahrscheinlich in ihrer Funktion als Nukleotidaustauschfaktoren für Ssa1, notwendig sind. Neben endgültig fehlgefalteten zytoplasmatischen Proteinen, entfernt das Ubiquitin Proteasom System (UPS) der eukaryontischen Zelle auch regulatorische Enzyme bei sich verändernden Umweltbedingungen. Werden Zellen von einem nicht-fermentierbarem auf fermentierbares Medium gewechselt, wird ein Schlüsselenzym der Gluconeogenese, Fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase), durch den Gid-E3-Komplex ubiquitinyliert und dann durch das UPS abgebaut, um von Gluconeogenese auf Glycolyse umzuschalten. In einer weiteren Studie konnte gezeigt werden, dass für den Abbau von ubiquitinylierter FBPase die Weiterverarbeitung durch die AAA-ATPase Cdc48 und seine Kofaktoren Ufd1 und Npl4 notwendig ist. Damit konnte zum ersten mal für ein natürliches Substrat des UPS eine Abhängigkeit vom Cdc48-Ufd1-Npl4 Komplex gezeigt werden. Auch konnte gezeigt werden, dass die Ubiquitinrezeptorproteine Dsk2 und Rad23 für den proteasomalen Abbau der FBPase notwendig sind. Vor dem Abbau eines ubiquitinylierten Substrates durch das Proteasom werden die Ubiquitinketten abgeschnitten. Die ubiquitin-spezifische Protease Ubp14 spaltet dann diese freien Ketten zu monomeren Ubiquitineinheiten. In UBP14 deletierten Hefestämmen akkumulieren Ubiquitinketten, was dazu führt, dass der gesamte UPS abhängige Proteinabbau gestört wird. In einer weiteren Studie konnte gezeigt werden, dass die Hemmung des proteasomalen Abbaus durch Deletion von UBP14 nicht, wie ursprünglich angenommen, für alle Substrate des UPS gleichermaßen gilt. Während z.B. der UPS abhängige Abbau des gluconeogenetischen Enzyms FBPase in ∆ubp14 Stämmen gehemmt ist, ist der Abbau von ∆ssCG* nur wenig und der von einem fehlgefalteten Substrat des Endoplasmatischen Retikulums (ER), CPY*HA, überhaupt nicht gestört. Dieser Befund deutet darauf hin, dass es verschiedene substratspezifische Wege zum Proteasom gibt, welche sich durch eine variierende Abhängigkeit von Ubp14 beschreiben lassen.