Die Endoplasmatisches Retikulum assoziierte Degradation (ERAD) eines fehlgefalteten Membran verankerten Proteins mit variierender zytoplasmatischer Domäne und die Entdeckung eines neuen ERAD-Weges

Abstract

Die Funktionalität neu synthetisierter Proteine ist unter anderem durch ihre korrekte dreidimensionale Faltung gegeben. Der Abbau von nicht funktionellen oder fehlgefalteten Proteinen schützt die Zelle vor Proteotoxizität, die zu schweren Beeinträchtigungen der Zellfunktion sowie Alzheimer-, Parkinson- und Creutzfeld-Jakob-Krankheit führt. Die Genauigkeit des Proteinreifungsprozesses ist so grundlegend wichtig, dass sich mehrere zelluläre Mechanismen entwickelt haben, die die Proteinfaltung überwachen. Das Endoplasmatische Retikulum (ER) spielt eine entscheidende Rolle bei der Proteinqualitätskontrolle (PQC; engl. protein quality control) und der Reifung sekretorischer Proteine. Der Austritt aus dem ER ist durch ein strenges Qualitätssystem geregelt, das fehlgefaltete Polypeptide und unvollendet zusammengebaute Untereinheiten erkennt und zurückhält. Unvollständig gefaltete oder fehlgefaltete Proteine werden dem ER-assoziierten Abbauweg (ERAD; engl. ER associated degradation) zugeführt. Die Retrotranslokation der fehlgefalteten Proteine über die ER-Membran ins Zytosol und der Abbau durch das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist für den ERAD-Prozess erforderlich. Die ER-Qualitätskontrolle (ERQC; engl. ER quality control) und die ERAD sind eng miteinander verbunden und wird auch ER-Qualitätskontrolle und -assoziierte Degradation (ERQD; engl. ER-quality control and degradation) genannt. Um zu untersuchen, ob die Faltungsintensität der zytosolischen Domäne für die substratspezifischen Anforderungen einiger ERAD-Komponenten verantwortlich ist, wurde eine Auswahl an fehlgefalteten Fusionsproteinen hergestellt, die die mutierte Carboxypeptidase Y (CPY*) im ER-Lumen als Degradationsmotiv tragen. Die Kollektion der fehlgefalteten Proteine mit unterschiedlicher zytosolischer Topologie besteht aus CTG*, CTL*myc und CTD*. Die durchgeführten Versuche mit Fusionsproteinen mit zytosolisch unterschiedlichen Topologien zeigten, dass Chaperone und andere Faktoren für die Entfaltung der zytosolisch stark gefalteten Domänen vor dem proteasomalen Abbau unerlässlich sind. Auftretende Unterschiede im Abbauverhalten können nur aufgrund der unterschiedlichen Faltungsstärken der zytosolischen Domänen der Substrate zustande kommen. Nichtsdestotrotz unterscheiden Zellen weniger zwischen schwach oder stark gefalteten Domänen. Die für den Abbau rekrutierten Komponenten werden abhängig von den charakteristischen Eigenschaften der zytosolischen Domänen ausgewählt. Frühere Arbeiten zur ERAD ließen erkennen, dass die Deletion einer oder beider bekannter ER-Membran lokalisierter E3-Ligasen, Hrd1/Der3 und Doa10, nicht die vollständige Stabilisierung der untersuchten Substrate bewirkt (Gnann et al., 2004; Huyer et al., 2004). Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass mindestens eine weitere E3-Ligase involviert sein muss, die den endgültigen Abbau einleitet. Ubr1 ist als E3-Ligase im N-end rule Weg (engl.) bekannt (Bartel et al., 1990; Varshavsky, 1996a) und ist Teil der Abbaumaschinerie fehlgefalteter zytosolischer Substrate (Eisele et al., 2008; Heck et al., 2010). Bei Fehlen der klassischen ER-E3-Ligasen Hrd1/Der3 und Doa10 werden die ERAD-L-Substrate CTG* und CTL*myc ubr1-abhängig vollständig abgebaut. Um herauszufinden, welche weiteren Komponenten in den neuen Ubr1-abhängigen Weg involviert sind, wurden bekannte Komponenten aus dem klassischen ERAD-Weg zusätzlich in einer Doppelmutante der3/hrd1 doa10 deletiert. Das ERAD-L-Substrat CTG* wird weiterhin polyubiquitiniert und über das 26S Proteasom abgebaut. Das Hsp40-Co-Chaperon Hlj1 ist am vollständigen Abbau von CTG* beteiligt. Die AAA-ATPase Cdc48, sowie Der1 und Dfm1 sind in diesem Abbauweg entbehrlich. Keines der bisher untersuchten Ubiquitin-konjugierenden E2-Enzyme, die aus dem klassischen ERAD-Weg und N-end rule Weg bekannt sind, sind in den ubr1-abhängigen Weg involviert. Vermutliche handelt es sich bei diesem Abbauweg um eine Art Reservesystem, das an geschalten wird, wenn der klassische ERAD-Weg mit dem Abbau der zytosolischen Domänen der ERAD-L-Substrate überfordert ist.

The functionality of newly synthesized proteins is acquired through folding into their correct three-dimensional structures. The degradation of non-functional or misfolded proteins protects the cell from proteotoxicity causing serious impairment of cell function and leading to Alzheimer-, Parkinson- and Creutzfeld-Jakob-disease in humans. The fidelity of the proteins maturation process is so important that several cellular mechanisms have evolved to monitor protein folding. The endoplasmic reticulum (ER) plays an essential role in protein quality control (PQC) and the maturation of secretory proteins. Exit from the ER is regulated by a strict quality control system that recognizes and retains misfolded polypeptides and orphan protein subunits. Incompletely folded or misfolded proteins are subjected to ER-associated degradation (ERAD) pathways. ERAD requires retrotranslocation of the misfolded proteins across the ER membrane into the cytosol and degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS). The ER-quality control (ERQC) and the ERAD process are closely related and termed ER quality control and associated degradation (ERQD). To investigate whether the differences in the tightness of folding is responsible for substrate-specific requirements of ERAD components, a set of three misfolded fusion proteins based on mutated Carboxypeptidase Y (CPY*) in the ER lumen as degradation motif was constructed. The three substrats consist of CTG*, CTL*myc and CTD*. The studies on the cytosolic topology variants of fusion proteins showed that chaperones and other factors are indispensable to unfold cytosolic tightly folded parts of the molecule before degradation. The differences in turnover could only occur because of different topologies of the cytosolic domains of substrates. Nevertheless, cells discriminate to a lesser extent between weakly and strongly folded cytosolic domains. The components necessary for degradation are recruited depending on the structural characteristics of cytosolic domains. Former studies on ERAD revealed that deletion of one or both of the two known ER membrane localized E3 ligases in same cases did not induce complete stabilization of the substrate tested (Gnann et al., 2004; Huyer et al., 2004). These findings argue for the involvement of at least one further E3 ligase that promotes the ultimate degradation. Ubr1 is known to act as an E3 ligase in the N-end rule pathway (Bartel et al., 1990; Varshavsky, 1996a) and – most interestingly – in the degradation of misfolded cytosolic proteins (Eisele et al., 2008; Heck et al., 2010). The ERAD-L substrats CTG* and CTL*myc are degraded completely in an ubr1-dependent manner in the absence of the canonical ER-E3-ligases Hrd1/Der3 and Doa10. To study the components involved in the novel Ubr1-dependent ERAD pathway, known components from this pathway were deleted in addition in S. cerevisiae strains with a Der3/Hrd1 Doa10 doublemutant-background. CTG* is further polyubiquitinated and degraded via the 26S Proteasome. The Hsp40 Co-Chaperon Hlj1 is also involved in the degradation of CTG*. The AAA-ATPase Cdc48, Der1 and Dfm1 are dispensable in this degradation pathway. No Ubiquitin-conjugating E2-enzyme investigated so far and known from the ERAD and N-end rule pathway is involved in the ubr1-dependent degradation pathway. Presumably the ubr1-dependet pathway form a back up system switching on when the classical ERAD-pathway is overstrained with the degradation of cytosolic domains of the ERAD-L substrats.