Surface plasmon resonance-based investigation of the human constitutive androstane receptor with regard to co-activator binding and ligand-dependent activation

Abstract

During detoxification, xenobiotics including pharmaceuticals are subject to biotransformation reactions which enable their excretion outside the cell and the human body. The cytochrome P450 monooxygenases (CYPs) are the most important group of enzymes in xenobiotic metabolism. CAR (constitutive androstane receptor) and PXR (pregnane X receptor) seem to be crucial for pharmaceutical metabolism, too. CAR belongs to the family of nuclear receptors and is mainly responsible for regulation of CYP2B6 in humans. The most outstanding property of the nuclear receptor CAR is its constitutive activity which results from ligand-independent recruitment of transcriptional co-activators unlike most classical nuclear receptors. Yet, it was also shown that CAR, due to exposure to Phenobarbital (PB), translocates from the cytoplasm into the nucleus of hepatocytes. The co-activators SRC-1 (steroid receptor co-activator 1) and SRC-2 (steroid receptor co-activator 2) belong to the p160 family of co-activators and co-activate many nuclear receptors among others CAR and ER (estrogen receptor). Though CAR recruits ligand-independently co-activators and, therefore, does not need agonist binding to be active, it has been shown that its activity can be further enhanced by interactions with agonists. In this study Biacore technology, which relies on the principle of surface plasmon resonance (SPR), was used to investigate and characterize the nuclear receptor CAR. Several drugs selected in the course of a screening performed at the IKP (Dr. Margarete Fischer-Bosch-Institut für Klinische Pharmakologie) were chosen to investigate the influence on CAR with regard to co-activator binding and ligand-dependent activation. For this purpose, the first goal was the soluble expression of both CAR and the co-activators SRC-1 and SRC-2 in E. coli cells, and the subsequent purification for binding experiments via SPR. The aim of this work was to investigate to what extent the selected drugs influence the constitutive association of CAR with SRC-1 or SRC-2 by means of SPR. Furthermore, the work aimed to characterize the kinetics of both the association and the dissociation of the receptor – co-activator complex in the presence and absence of ligands. Additionally, the examination of the ligand-free interaction aimed to characterize the constitutive binding of receptor and co-activator. Binding experiments of immobilized SRC-1 with CAR in the presence of the selected drugs revealed a distinctive ligand-dependent hierarchy in association of receptor and co-activator which allowed a discrimination of the drugs into non- or low, weak, and strong binders of the receptor. The association hierarchy included Arteether > CITCO > Triphenylphosphate to be the three most competent agonists. Thus, CAR – SRC-1 interaction appears to be more susceptible to regulation by the selected drugs, especially by the pharmaceutically relevant substances Arteether and Clofibrate. Since ligand-induced binding of CAR and SRC-1 proved to be significantly diminished by Clotrimazole, side effects including cross reactivity caused by the simultaneous taking of the inverse agonist and Arteether or Clofibrate may occur in vivo. Yet, Clotrimazole could only be partly confirmed as inverse agonist of CAR since it did not lead to co-activator release in the absence of ligands. Yet, the co-activator SRC-1, unlike SRC-2, revealed to be a powerful tool of identification and characterization of putative agonists which might distinctively influence the constitutive binding with CAR. Kinetic binding assays demonstrated that the constitutive binding of CAR with SRC-1 occurred nine times faster than with SRC-2 whereas the stability of both receptor - co-activator complexes revealed to be low but displayed no distinctive differences. Thus, both ligand-induced binding experiments and ligand-free kinetic assays strongly indicate that SRC-1 is the prime co-activator of interest for CAR regardless of expression levels and tissue-specific expression profiles. Surprisingly, equilibrium dissociation constants of ligand-induced kinetic binding assays of CAR and SRC-1 revealed weaker affinities when interactions took place with all agonists, indicating that no ligand was able to accelerate recognition of SRC-1. Furthermore, two classes of CAR ligands were revealed. The first class of ligands including Artemether, Triphenylphosphate, and Fenofibrate led to the formation of more complexes, as demonstrated by ligand-induced increase in binding, but could not enhance the stability of the complex. The second class of ligands which comprised CITCO, Clofibrate, Arteether, and Artemisinin furthermore enhanced the stability of the complex but also caused distinctively slower association rates which might be assigned to a two-step association. Unlike the HMG-CoA reductase inhibitor Atorvastatin and its metabolites, Fenofibrate and Clofibrate, were identified as CAR agonists.

Xenobiotika, einschließlich Arzneimittel, unterliegen während der Detoxifikation Biotransformationsreaktionen, die eine Ausscheidung außerhalb der Zelle und des Körpers ermöglichen. Die Cytochrom P450-Monooxygenasen (CYPs) stellen die wichtigste Gruppe von Enzymen des Fremdstoffmetabolismus dar. CAR (constitutive androstane receptor) und PXR (pregnane X receptor) scheinen ebenfalls ausschlaggebend für den Metabolismus von Pharmazeutika zu sein. CAR gehört zur Familie von Kernrezeptoren und ist überwiegend für die Regulierung von CYP2B6 verantwortlich. Die hervorstechendste Eigenschaft des Kernrezeptors CAR ist seine konstitutive Aktivität, die durch eine liganden-unabhängige Rekrutierung von transktriptionsrelevanten Koaktivatoren erfolgt. Jedoch konnte belegt werden, dass aufgrund von Einwirkung von Phenobarbital (PB) CAR aus dem Cytoplasma in den Kern von Hepatozyten transloziert. Allerdings aktiviert PB CAR nicht durch direkte Bindung, sondern durch eine Signalkaskade, die abhängig von PP2A (protein phosphatase 2A) zur Dephosphorylierung des Rezeptors führt. Die Koaktivatoren SRC-1 (steroid receptor co-activator 1) und SRC-2 (steroid receptor co-activator 2) gehören zur Familie der p160 Koaktivatoren. Obwohl CAR Liganden-unabhängig Koaktivatoren rekrutiert und aus diesem Grund nicht auf die Bindung eines Agonisten angewiesen ist, um aktiv zu sein, konnte gezeigt werden, dass seine konstitutive Aktivität durch Interaktionen mit einem Liganden zusätzlich erhöht werden kann. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde mithilfe des Biacore 3000 der Kernrezepor CAR untersucht und charakterisiert. Das Biacore 3000 beruht auf dem Prinzip der Oberflächenplasmonresonanz (Surface Plasmon Resonance, SPR). Verschiedene Substanzen wurden aus einem Screening, welches am IKP (Dr. Margarete Fischer-Bosch-Institut für Klinische Pharmakologie) durchgeführt wurde, ausgewählt um den Einfluss auf CAR in Bezug auf die Bindung der Koaktivatoren und die Liganden-abhängige Aktivierung zu untersuchen. Eines der Hauptziele war herauszufinden in welchem Ausmaß die ausgewählten Substanzen die konstitutive Assoziation von CAR mit SRC-1 oder SRC-2 beeinflussen. Außerdem sollte die Kinetik der Assoziation als auch der Dissoziation des Rezeptor – Koaktivator Komplexes in Anwesenheit und Abwesenheit von Liganden analysiert werden. Die Liganden-abhängigen Bindungsassays von CAR und SRC-1 offenbarten eine Hierarchie basierend auf der Rezeptor – Koaktivator Assoziation, die eine Klassifizierung der untersuchten Substanzen in Kategorien von keinen, schwachen oder starken Bindungspartnern ermöglichte. CITCO führte zu einer 7,3-fach und sowohl Clofibrat als auch Arteether zu einer 5,3-fach höheren Bindung, und bildeten somit die Gruppe der drei effizientesten CAR Agonisten. Anhand der SPR-basierten Bindungsassays konnten Clofibrat und Fenofibrat als CAR Agonisten identifiziert werden wobei ersteres einen deutlich höheren Einfluss hatte. Die Anwesenheit eines Liganden hatte starken Einfluss auf die CAR – SRC-1 aber nur einen geringen auf die CAR – SRC-2 Assoziation. Im Gegensatz zu den Fibraten, wurden die Atorvastatinmetabolite nicht als CAR Agonisten identifiziert. Da der HMG-CoA Reduktaseinhibitor unter anderem die Expression von CYP2B6 induziert, ist es wahrscheinlich, dass die CAR Aktivierung über eine PB-änliche Signalkaskade erfolgt. Clotrimazol konnte nur zum Teil als inverser Agonist bestätigt werden, da die Liganden-unabhängige Rezeptor – Koaktivator Bindung nicht inhibiert wurde. Die kinetischen Bindungsassays offenbarten, dass die Liganden-unabhängige Rezeptor – Koaktivator Bindung neun mal schneller mit SRC-1 erfolgte als mit SRC-2. Die Stabilität des Komplexes hingegen war relativ betrachtet schwach und für beide Koaktivatoren ähnlich. Sowohl die Liganden-abhängigen Bindungsassays als auch die Liganden-unabhängigen kinetischen Assays lassen erkennen, dass SRC-1, abgesehen von gewebespezifischen Expressionsprofilen, von CAR bevorzugt wird. Da die Liganden-abhängigen Bindungsassays eine charakteristische Verstärkung der Assoziation zeigten, wurden kinetische Assays durchgeführt um den tatsächlichen Einfluss der Liganden auf die Kinetik des CAR – SRC-1 Komplexes zu bestimmen. Überraschenderweise wies der Rezeptor – Koaktivator Komplex geringere Affinitäten auf, und ließ somit vermuten, dass kein Agonist zu einer schnelleren Erkennung von SRC-1 geführt hat. Jedoch zeigten die Liganden-abhängigen Kinetikassays auch, dass offensichtlich zwei Klassen von CAR Liganden existieren. Liganden der ersten Klasse (Artemether, Triphenylphosphat und Fenofibrat) führten zwar zur Bildung von mehr CAR – SRC-1 Komplexen, konnten aber deren Stabilität nicht erhöhen. Die zweite Klassse von CAR Liganden umfasste CITCO, Clofibrat, Arteether und Artemisinin. Diese Gruppe führte zu mehr Komplexbildung und zu einer erhöhten Rezeptor – Koaktivator Stabilität.