Design and application of a DNA microarray for the identification of intestinal pathogens during gastroenteritis and monitoring of the resident intestinal microbiota

Abstract

Bacterial gastroenteritis is a commonly occurring disorder with three to five billion cases of acute diarrhea annually worldwide, particularly in developing countries where it is a leading cause of childhood morbidity and mortality. Diarrheal diseases can quickly reach epidemic dimensions, especially in the case of food-borne pathogens. Fast identification of the etiologic agent remains a key task in clinical diagnosis. Currently, it is mainly based on phenotypic classification using stool culture and a set of morphological, physiological, and serological tests. However, cultivation of the intestinal pathogen can often be a challenging and time-consuming task. Microarrays can fulfil the need for a rapid diagnostic tool that generates reliable information with a minimum of laboratory effort and do not rely on cultivation of the organisms. Here, a diagnostic oligonucleotide microarray was developed to detect the most common bacterial species associated with gastroenteritis. As a new concept, the array aimed at also providing information about the residential flora and potential probiotics. This combination allows not only pathogen identification but also a monitoring of the patients gut flora recovery during therapy. The developed array comprised probes for 23 species and 11 genera following a multiple-probe concept. This covers also 13 common bacterial gastroenteritis-related pathogens. The DNA array performance was initially verified with pure cultures from clinical isolates and DSM strains and confirmed by sequencing. The final array allowed unambiguous identification of the target species by combining the multiple-probe concept with a robust cut-off. The limit of detection was determined to be 103 genome equivalents. The clinical applicability was examined by processing stool samples from 58 patients with gastroenteritic symptoms and 6 healthy individuals using the diagnostic microarray. For 30 samples where the etiologic pathogen had been detected by a combination of culture and specific real-time PCR assays, 67% of these samples were correctly identified. It was assumed that a higher recovery rate would require a lower detection limit of the array. Furthermore, highly individualized communities of the detected resident bacteria were found in the analysed samples. A difference of this microbiota between healthy and infected subjects was not observed by multivariate analysis of the array data. This was attributed to the inhomogeneous sample group in terms of patient age and clinical diagnose. Additionally, the array was applied to investigate the influence of a viral, intestinal infection on the composition of the infantile microbiota and the establishment of human and porcine intestinal community in inoculated piglets. In both trials, also bacterial pathogens could be identified. Multivariate analysis of the microarray data revealed a significant difference of the resident flora between healthy and infected children and between the pig and human intestinal flora. Partial least squares analysis and one-way analysis of variance allowed identification of resident species or genera, which significantly differed between these groups. According to literature survey, this was the first application of principle component and partial least squares analysis for statistical evaluation of identification microarray data. The results indicated the applicability of the present microarray for studying the resident microbiota under a certain question. Nevertheless, it was concluded that more species should be included in the array to allow in-depth analysis of faecal microbiota. To address the problem of reliable quantification of intestinal bacteria and pathogens with a concentration range over several orders of magnitude using microarrays, a FRET-based system was developed. A black hole quencher was used to gradually quench the Cyanine 3 reporter signal allowing detection of a target species in the linear scanner range independent from its initial concentration. The proof of concept based on E. coli-specific probes showed that an effective quenching of the fluorophore label in the target was possible upon hybridization and dependent on the amount of immobilized quencher. It was concluded that two spots would be sufficient to detect 104 up to 2*106 genome equivalents in the linear range of the scanner. This setup partly overcomes the technical limitation of linear fluorescence signal acquisition for different amounts of bacteria. In summary, in this study solutions for two problems of molecular pathogen detection in the clinic were developed: (1) the time for pathogen detection and (2) the assay coverage. The analytical sensitivity for clinical application was not yet sufficient due to limitations of the pre-analytical procedures. A general concept to expand the linear range of a fluorescence intensity based detection system was achieved by a FRET-based system with immobilized quencher on the array surface.

Bakterielle Gastroenteritis ist mit weltweit 3-5 Millionen Fällen pro Jahr eine verbreitete Erkrankung, die als ein Hauptgrund für Kindersterblichkeit besonders stark Entwicklungsländer betrifft. Diarrhöe kann insbesondere im Falle von Lebensmittel-vergiftungen relativ schnell die Dimension einer Epidemie erlangen. Die schnelle Identifizierung des auslösenden Pathogens bleibt nach wie vor die Kernaufgabe in der klinischen Diagnostik dieser Erkrankung. Gegenwärtig basiert diese überwiegend auf der phänotypischen Klassifikation von Stuhlkulturen unter Verwendung von morphologischen, physiologischen und serologischen Tests. Die Kultivierung intestinaler Pathogene kann jedoch schwierig und zeitaufwändig sein. Mikroarrays können als schnelle, diagnostische Werkzeuge dienen, die Informationen mit minimalem Laboraufwand und unabhängig von der Kultivierung der Organismen liefern. In der vorliegenden Arbeit wurde ein diagnostischer Oligonukleotid-Mikroarray für die Detektion der verbreitetesten bakteriellen Gastroenteritiserreger entwickelt. Das Ziel mit dem Array auch Informationen über die residente Darmflora sowie potentiell probiotische Bakterien zu generieren, stellt ein neues Konzept für diagnostische DNA-chips dar. Diese Kombination erlaubt nicht nur die Pathogenidentifizierung sondern auch die Beobachtung der Regeneration der intestinalen mikrobiellen Gemeinschaft während der Therapie. Der entwickelte Array beinhaltet Sonden zur Detektion von 23 Spezies und 11 Gattungen unter Anwendung eines Mehrsonden-Konzepts. Diese decken die 13 verbreitetesten bakteriellen Gastroenteritiserreger ab. Die Funktion des Arrays wurde zunächst mit Reinkulturen aus klinischen Isolaten und DSM-Stämmen validiert und durch Sequenzierung bestätigt. Der endgültige Mikroarray ermöglichte die zweifelsfreie Bestimmung der Zielspezies durch eine Kombination des Mehrsonden-Konzepts mit einem robusten cut-off. Das Detektionslimit wurde auf 103 Genomäquivalente bestimmt. Die klinische Anwendbarkeit des Arrays wurde durch Untersuchung von Stuhlproben von 58 Patienten mit gastroenteritischen Symptomen und 6 gesunden Individuen überprüft. Von 30 Proben, bei denen das ätiologische Agens bereits mit einer Kombination aus Stuhlkultur und spezifischer real-time PCR detektiert wurde, wurden 67% korrekt identifiziert. Es wurde geschlussfolgert, dass eine höhere Wiederfindungsrate eine bessere Sensitivität des Assays erfordern würde. Darüber hinaus wurde der Mikroarray zur Untersuchung des Einflusses einer viralen, intestinalen Infektion auf die Zusammensetzung der kindlichen Intestinalmikrobiota und der Etablierung von menschlicher und Schweine-Intestinalmikrobiota in inokkulierten Mini-Schweinen verwendet. In beiden Versuchen wurden auch bakterielle Pathogene identifiziert. Mit Hilfe einer Multivarianzanalyse der Arraydaten wurde ein signifikanter Unterschied in der Zusammensetzung der Intestinalmikrobiota zwischen gesunden und infizierten Kindern bzw. zwischen menschlicher und Schweineintestinalmikrobiota festgestellt. Die Anwendung von Partial Least Squares Pfadanalyse und einfaktorieller Varianzanalyse ermöglichte die Offenlegung der Spezies bzw. Gattungen, die sich in ihrer Präsenz in den jeweiligen Gruppen signifikant unterschieden. Laut einer Literaturrecherche zum Thema ist dies die erste Anwendung der Hauptkomponentenanalyse und Partial Least Squares Pfadanalyse für die statistische Auswertung von Identifikationsmikroarraydaten. Um das Problem einer verlässlichen Quantifizierung der intestinalen Bakterien und Pathogene auf dem Mikroarray über die Spanne mehrerer Zehnerpotenzen zu lösen, wurde ein FRET-basiertes System evaluiert. Ein black hole quencher wurde zur graduellen Löschung des Cyanin 3-Reportersignals eingesetzt, wodurch die Detektion der Zielspezies im linearen Bereich des Scanners unabhängig von deren Ausgangskonzentration ermöglicht wurde. Der Nachweis des Wirkprinzips wurde anhand von E. coli und dessen spezifischen Sonden erbracht und zeigte, dass ein effizientes quenching des Fluorophores in der Ziel-DNA nach deren Hybridisierung in Abhängigkeit vom der im spot immobilisierten quencher-Menge möglich ist. Es wurde geschlussfolgert, dass zwei spots ausreichend sind um 104 bis 2*106 Genomäquivalente im linearen Scannerbereich zu detektieren. Diese Anordnung überwindet teilweise die technische Einschränkung bei der linearen Fluoreszenzsignalerfassung für verschiedene Bakterienmengen. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Entwicklung des Gastroenteritis-Chips zwei Hauptprobleme der klinischen Pathogendetektion, die benötigte Detektionszeit und Assayabdeckung möglicher Pathogene, gelöst hat. Für die klinische Anwendung ist jedoch die Sensitivität noch verbesserungswürdig. Darüber hinaus, konnte ein Konzept für ein lineares Quantifizierungssystem auf Mikroarrays über mehrere Zehnerpotenzen entwickelt werden.