Improvements to the instanton method : tunneling rates in the enzyme glutamate mutase

Abstract

Atom tunneling occurs in many chemical reactions involving hydrogen transfers. Tunneling increases the reaction rate compared to the classical over-the-barrier model especially at low temperature. In many enzymes tunneling of hydrogen atoms influences the reaction rate even at room temperature which can experimentally be observed by unusually high kinetic isotope effects (KIEs). A high KIE shows that tunneling accelerates the rate limiting step. Computer simulations can directly quantify the effect of tunneling in a reaction by switching it on and off.

The enzyme glutamate mutase catalyzes the radical conversion mechanism of (S)-glutamate to (2S,3S)-3-methylaspartate including two hydrogen transfer steps. The protium/deuterium KIEs measured in glutamate mutase range from 4.1 to 35 at 10°C. Thus, it is unclear whether tunneling is involved or important for the catalytic process. Glutamate mutase is studied by a multiscale approach combining quantum mechanics with molecular mechanics (QM/MM), with quantum mechanical (QM) calculations used for the atoms directly involved in bond rearrangements and force field calculations (MM) for the environment. The QM part is investigated with density functional theory and coupled cluster theory.

The results of the QM/MM simulations show new details of the catalyzed reaction and lead to an improved understanding of the catalysis by glutamate mutase: the conversion of (S)-glutamate to (2S,3S)-3-methylaspartate is found to proceed via a fragmentation-recombination mechanism. The involved hydrogen atom transfer steps exhibit the highest barrier, 101 kJ/mol (M06 functional). The barriers of the hydrogen transfers match for density functional theory (M06 functional) and coupled cluster (LUCCSD(T)) calculations. It turned out that the influence of the enzyme is mainly electrostatical and to a lesser degree sterical. The calculations shed light on the atomistic details of the reaction mechanism. The well-known arginine claw (Arg 66, Arg 100, and Arg 149) and Glu 171 are found to have the strongest influence on the reaction. The arginine claw keeps the intermediate fragments in place, and is important for the recombination process. However, significant catalytic roles of amino acids close to the active center, e.g., Glu 214, Lys 322, Gln 147, Glu 330, Lys 326, and Met 294 are found as well. These results predict new promising experimental targets.

The role of tunneling in the enzyme glutamate mutase is investigated by QM/MM simulations based on instanton theory with up to 78 atoms allowed to tunnel. Primary protium/deuterium KIEs of hydrogen transfers are in good agreement with experiment. The secondary tritium KIEs hint that coupled motions on a ribose ring of the cofactor are part of the tunneling motions. The enzyme uses both classical and tunneling motions for a successful catalysis.

The instanton method (also called imaginary free energy method) is based on Feynman's path integral formalism. The instanton is the most-likely tunneling path. The instanton is also a first-order saddle point of the Euclidean action. The problem of finding an instanton is addressed as a saddle-point search problem. Four algorithms implemented to locate instantons are compared: a modified Newton-Raphson method, the partitioned rational function optimization algorithm, the dimer method, and a newly proposed mode-following algorithm. These algorithms are tested on three chemical systems. Overall, the Newton-Raphson turns out to be the most promising method, consistently efficient and stable, with the newly proposed mode-following method being the fall-back option.

Two bottlenecks are challenging in instanton rate calculations: (1) Hessian calculations subsequent to the instanton optimization are expensive for large systems like enzymes. (2) At lower temperature more and more discretization points (images) on the equidistantly discretized path tend to accumulate at the ends of the instanton path. Thus, methods that allow to use fewer discretization points for the same quality in the rates are required.

The development of a quadratically convergent optimizer significantly increases the efficiency of instanton optimizations. In combination with a new, flexible, and variable discretization of the integration along the instanton, the computational costs are reduced by one or two orders of magnitude.

Tunneln von Atomen tritt in vielen chemischen Reaktionen auf, vor allem bei solchen, die Wasserstoffatome involvieren. Besonders im Bereich tiefer Temperaturen erhöht der Tunneleffekt die Reaktionsraten im Vergleich zum klassischen Modell, bei dem die Edukte mit genügend Aktivierungsenergie über die Reaktionsbarriere auf die Produktseite gelangen. Bei vielen Enzymen beeinflusst das Tunneln von Wasserstoffatomen sogar bei Raumtemperatur die Reaktionsrate, was sich experimentell in einem ungewöhnlich hohen kinetischen Isotopeneffekt (KIE) zeigt. Ein hoher KIE weißt darauf hin, dass Tunneln den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt einer Reaktion beschleunigt. Computersimulationen können die Bedeutung von Tunneleffekten in einer Reaktion direkt zeigen, da sie das An- oder Ausschalten des Effekts erlauben.

Glutamatmutase ist ein Enzym, das die Umlagerung von (S)-Glutamat zu (2S,3S)-3-Methylaspartat über eine Radikalreaktion katalysiert. Die für Glutamatmutase gemessenen Protium/Deuterium KIEs reichen von 4.1 bis 35 bei 10°C. Daher ist unklar, ob Tunneln für die Katalyse eine Rolle spielt. Das Enzym Glutamatmutase wird mit einem Multiskalenansatz, einer Kombination aus Quantenmechanik und Molekularmechanik (QM/MM), untersucht. Dabei werden quantenmechanische (QM) Rechnungen für Atome, die direkt an der Umlagerung der Bindungen beteiligt sind, verbunden mit Kraftfeldrechnungen (MM) zur Beschreibung der Umgebung verwendet. Der QM-Teil wird mit Dichtefunktionaltheorie und Coupled Cluster beschreiben.

Die Ergebnisse der QM/MM-Simulationen zeigen neue Details der katalysierten Reaktion auf Atom- und Elektronenebene und führen zu einem verbesserten Verständis der Katalyse durch Glutamatmutase: Die Umlagerung von Glutamat zu Methylaspartat verläuft über einen Fragmentierungs-Rekombinations-Mechanismus. Die Zwischenschritte, in welchen Wasserstoffatome übertragen werden, weisen die höchste Barriere auf, 101 kJ/mol (M06 Funktional). Für diese Reaktionsschritte stimmen die Barrieren, der Dichtefunktionaltheorie (M06 Funktional) und Coupled Cluster (LUCCSD(T)) Rechnungen überein. Es zeigt sich, dass der Einfluss des Enzyms überwiegend elektrostatisch und zu einem geringeren Anteil sterisch bedingt ist. Die Rechnungen demonstrieren Details des Reaktionsmechanismus auf atomarer Ebene. Die Argininkralle (Arg 66, Arg 100, und Arg 149) und die Aminosäure Glu 171 haben den stärksten Einfluss auf die Reaktion. Die Argininkralle hält die Fragmente (Zwischenprodukte der Reaktion) an ihrer Position. Sie spielt eine wichtige Rolle bei der Rekombination der Fragmente. Jedoch haben auch mehrere andere Aminosäuren, z.B. Glu 214, Lys 322, Gln 147, Glu 330, Lys 326 und Met 294, in der Nähe des aktiven Zentrums signifikanten Einfluss auf die Reaktivität des Enzyms.

Die Rolle des Tunneleffekts in Glutamatmutase wird mit QM/MM-Simulationen basierend auf Instantontheorie mit bis zu 78 Atomen, die tunneln dürfen, untersucht. Die primären Protium/Deuterium KIEs der Wasserstoffüberträge stimmen gut mit den experimentellen Ergebnissen überein. Die sekundären Tritium KIEs weisen darauf hin, dass gekoppelte Bewegungen am Ribosering des Kofaktors Teil der Tunnelbewegung sind. Das Enzym verwendet sowohl klassische Bewegungen als auch Tunnelbewegungen für eine erfolgreiche Katalyse.

Die Instantonmethode (auch Imaginary F Methode genannt) basiert auf Feynmans Pfadintegralformalismus. Das Instanton ist der optimale Tunnelpfad, der den größten Beitrag zur Tunnelrate liefert. Dieser ist ein Sattelpunkt erster Ordnung des euklidischen Wirkungsfunktionals. Vier Algorithmen zur Instantonsuche wurden implementiert und verglichen: das Newton-Raphson Verfahren, der partitioned rational function optimization Algorithmus, die Dimermethode und eine weitere neu vorgeschlagene auf Gradienten basierende Methode. Das Newton-Raphson Verfahren zeigte die beste Stabilität und Effizienz. Die neu vorgeschlagene Methode kann als Alternative dienen.

Zwei Herausforderungen sind bei der Berechnung von Instanton-Tunnelraten in Glutamatmutase zu meistern: (1) Die Berechnungen der Hessematrix, die auf die Instantonoptimierungen folgen, sind für große Systeme wie z.B. Enzyme teuer. (2) Bei niedriger Temperatur tendieren immer mehr Diskretisierungspunkte (Bilder) auf einem equidistant diskretisierten Pfad dazu, sich an den Enden des Instantonpfades anzuhäufen. Daher sind Methoden notwendig, die es ermöglichen, weniger Diskretisierungspunkte bei gleicher Qualität der Rate zu verwenden.

Die Entwicklung eines quadratisch konvergenten Optimierers zur Instantonbestimmung steigert die Effizienz der Simulationen signifikant. In Kombination mit einer neuen, flexiblen und variablen Diskretisierung der Integration entlang des Instantons reduziert sich der Rechenaufwand um ein bis zwei Größenordnungen.