Characterization of the substrate specificity of squalene-hopene cyclases (SHCs)

Abstract

Cyclic terpenoids form a large group of natural products with various biological functions. About 60,000 different cyclic terpenoids have been identified by now, containing scaffolds of ten to more than 30 carbon atoms. Among this huge amount of different cyclic compounds, there are many well-known flavors and fragrances, such as menthol or limonene, compounds which are widely used for pharmaceutical purposes like the antitumor compound Taxol and the anti-malaria agent artemisinin, or common membrane constituents and hormones such as the sterols. All of these natural products are derived from cyclization reactions of few linear precursor molecules catalyzed by terpenoid cyclases. The main focus of the present work rests on one very interesting family of the terpenoid cyclases, the squalene-hopene cyclases (SHCs). Among the over 300 annotated SHCs, most extensive studies had been carried out characterizing the SHC from the thermophilic bacterium Alicyclobacillus acidocaldarius (AacSHC), solving the crystal structure and the complex cyclization mechanism of the C30 precursor squalene into the pentacyclic products hopene and hopanol. This reaction constitutes one of the most complex reaction mechanisms found in nature, including the stereospecific formation of nine stereocenters and 13 covalent bonds.13 Besides AacSHC, several SHCs were partially characterized in previous works. Our interest was triggered by the ethanol and sugar tolerant strain Zymomonas mobilis which is known as one of the most potent hopanoid producers. Zymomonas mobilis contains two genes encoding for SHCs: ZmoSHC1 and the formerly partially characterized ZmoSHC2. It could be shown that the SHCs are also capable of cyclizing other linear terpenoids. For example, it was found that truncated squalene analogs were accepted as substrates by AacSHC and also the alcohol homofarnesol could be converted into the corresponding cyclic ether ambroxan.16–19 These results indicate that SHCs represent a promising family for catalysis of very different and complex cyclization reactions. Thus, we decided to investigate the SHCs’ potentials regarding their substrate specificities. In order to characterize the squalene-hopene cyclases ZmoSHC1 and ZmoSHC2 and compare them with AacSHC especially regarding their biocatalytic activities towards unnatural substrates, the SHCs were cloned and heterologously expressed in Escherichia coli. Functional expression was confirmed by conversion of the natural substrate squalene. For the direct comparison, a protocol for partial purification of the membrane-anchored SHCs was elaborated and optimized. For this partial purification as well as for the conversion of the hydrophobic substrates in aqueous milieu a suitable detergent had to be selected. ZmoSHC1 was characterized in more detail, retrieving information about pH- and temperature-dependence of the activity and the biocatalytic stability over a long period of time as well as inhibitory effects. All of the three enzymes were tested with unnatural substrates of C10-C18 carbon chain lengths. A special focus was laid on substrates containing functional groups such as hydroxyl , carboxy- or keto-groups expected to participate in the cyclization reaction, as shown for the hydroxyl-group of homofarnesol. Several of the substrates were accepted and cyclic products were generated. Interestingly, the functional groups were integrated in the final ring closure and to products with new properties were obtained. Homofarnesol conversion yielding the cyclic ether ambroxan, which is known as a expensive and rare flavor compound, was observed as reported in the literature. Also the corresponding carboxylic acid, homofarnesoic acid, could be converted into the cyclic lactone sclareolide. The C15 tertiary alcohol nerolidol was accepted as substrate and the bicyclic ether caparrapioxide was formed. Lastly, two ketones were accepted as substrates leading to cyclic enol ether products. Within the present work, all of these new products were characterized after preparative biotransformation and product isolation. Not only the facts that these substrates are much shorter than the natural substrate squalene and possess different functional groups which take part in the cyclization reaction and that useful products containing new properties are formed, but also the different activities of the SHCs towards these substrates are remarkable. Thus, it could be shown that ZmoSHC1 exhibits special biocatalytic properties, as the substrate activity pattern was unexpected. While squalene was converted very poorly, good activity was found towards the reaction of homofarnesol to ambroxan. All of the other substrates were converted in low but significant rates into the corresponding cyclic products. A completely different substrate activity pattern was observed using AacSHC as biocatalyst. Besides very good squalene conversion, much lower activities towards all of the other substrates were found. Using ZmoSHC2, only very low conversion rates were found for squalene and farnesylacetone and no conversion of any of the other substrates. Based on these observations, it can be concluded that ZmoSHC1 represents a versatile biocatalyst for complex cyclization reactions, as it shows unexpected substrate activity towards other substrates than squalene. In the present work, these and further detailed results are described. Besides the examination of the SHCs’ activities towards different substrates there were also several mutants created in order to find explanations for the differences between the SHCs regarding their substrate activities. This characterization of the triterpenoid cyclase ZmoSHC1 and discussion of their special properties leads to new conclusions about the potential of SHCs to serve as potent biocatalysts for new reactions.

Die zyklischen Terpenoide stellen eine große Gruppe von Naturstoffen mit verschiedensten biologischen Funktionen dar. Bis heute konnten etwa 60.000 verschiedene zyklische Terpenoide, die aus Gerüsten von zehn bis über 30 Kohlenstoffatomen aufgebaut sind, identifiziert werden. Unter dieser großen Anzahl von zyklischen Stoffen finden sich viele bekannte Duft- und Aromastoffe, wie zum Beispiel Menthol oder Limonen, Verbindungen, die als pharmazeutisch wirksame Inhaltsstoffe in Medikamenten Anwendung finden, wie etwa der gegen Tumor wirksame Stoff Taxol oder das gegen Malaria angewendete Artemisinin oder auch die als Membranbestandteile und Hormone bekannten Steroide. All diese interessanten Naturstoffe werden durch Zyklisierung von wenigen linearen Vorläufermolekülen gebildet. Diese Zyklisierungsreaktionen werden von Terpenoid Zyklasen katalysiert. Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit liegt auf einer Unterfamilie dieser Enzymgruppe der Terpenoid Zyklasen, den Squalen-Hopen Zyklasen (SHCs). Unter den über 300 annotierten SHCs wurde die SHC vom thermophilen Bakterium Alicyclobacillus acidocaldarius (AacSHC) am besten untersucht. Neben der Kristallstruktur wurde auch der komplexe Mechanismus aufgeklärt, nach dem das lineare C30 Substrat Squalen zu den pentazyklischen Produkten Hopen und Hopanol zyklisiert wird. Der Mechanismus dieser Reaktion, bei der neun Stereozentren und 13 kovalente C-C Bindungen spezifisch entstehen, gilt als einer der komplexesten, die man in der Chemie der Naturstoffe bislang entdecken konnte. Neben AacSHC wurden in vorangehenden Arbeiten auch einige andere SHCs teilweise charakterisiert. Von besonderem Interesse ist hierbei der gegen hohe Alkohol- und Zuckerkonzentrationen tolerante Stamm Zymomonas mobilis, der als einer der besten Hopanoid-produzierenden Bakterienstämme bekannt ist und zwei Gene enthält, die für SHCs codieren: ZmoSHC1 und die in vorherigen Arbeiten partiell charakterisierte ZmoSHC2. Es war gezeigt worden, dass SHCs neben dem natürlichen Substrat Squalen auch einige andere lineare Terpenoide als Substrate akzeptieren und diese zyklisieren. Zum Beispiel konnten verkürzte Squalen-Analoga von AacSHC zyklisiert werden und auch der C16-Alkohol Homofarnesol wurde in den entsprechenden zyklischen Ether Ambroxan umgesetzt. Diese Ergebnisse ließen darauf schließen, dass die SHCs eine vielversprechende Enzymfamilie zur Katalyse von sehr verschiedenen, komplexen Zyklisierungsreaktionen darstellen könnten und deswegen entschieden wir uns dazu, die Substratbreite der SHCs näher zu untersuchen. Um die Squalen-Hopen Zyklasen ZmoSHC1 und ZmoSHC2 zu charakterisieren und ihre biokatalytischen Aktivitäten mit der von AacSHC vergleichen zu können, wurden die für diese Enzyme codierenden Gene kloniert und heterolog in Escherichia coli exprimiert. Die Expression funktioneller Enzyme wurde durch Umsetzung des natürlichen Substrates Squalen bestätigt. Um die Enzyme direkt miteinander vergleichen zu können, wurde ein Protokoll für die partielle Aufreinigung der membrangebundenen SHCs ausgearbeitet und optimiert. Für diese Aufreinigung sowie für die Umsetzung der hydrophoben Substrate in wässrigem Milieu musste ein geeignetes Detergenz verwendet werden. ZmoSHC1 wurde des Weiteren näher charakterisiert, wobei die pH- und Temperaturabhängigkeit der katalytischen Aktivität, die biokatalytische Stabilität des Enzyms über eine längere Zeitdauer sowie Inhibierungseffekte untersucht wurden. Die drei Enzyme wurden auf Aktivität gegenüber unnatürlichen Substraten mit C-Kettenlängen von C10-C18 getestet. Ein besonderer Fokus wurde hierbei auf Substrate gelegt, die funktionelle Gruppen enthalten, wie zum Beispiel Hydroxyl-, Carboxy- oder Ketogruppen, die, wie für die Hydroxylgruppe von Homofarnesol gezeigt, an der Zyklisierungsreaktion teilnehmen könnten. Interessanterweise wurden diese funktionellen Gruppen in den finalen Ring der polyzyklischen Produkte integriert, wodurch Produkte mit neuen, attraktiven Eigenschaften entstanden. Homofarnesol konnte in den zyklischen Ether und bekannten Duftstoff Ambroxan umgesetzt werden. Die entsprechende Carbonsäure Homofarnesolsäure wurde ebenfalls als Substrat akzeptiert und es wurde das zyklische Lakton Sclareolid erhalten. Der tertiäre C15 Alkohol Nerolidol wurde zum bizyklischen Caparrapioxid umgesetzt. Des Weiteren wurden auch zwei Ketone als Substrate akzeptiert und in zyklische Enolether umgesetzt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die neuen Produkte nach präparativer Biotransformation und Aufreinigung charakterisiert. Nicht nur die Tatsache, dass diese Substrate sehr viel kürzere Kohlenstoff-Ketten als das „natürliche“ Substrat Squalen besitzen und über verschiedene funktionelle Gruppen verfügen, die an den Zyklisierungsreaktionen teilhaben und zu interessanten Produkten umgesetzt werden, sondern auch die unterschiedlichen Aktivitäten der SHCs gegenüber dieser Substrate sind bemerkenswert. Es konnte gezeigt werden, dass ZmoSHC1 über besondere Eigenschaften verfügt, da unerwartete Umsetzungsraten bei der Katalyse mit diesem Enzym bestimmt wurden. Während die Zyklisierung von Squalen von ZmoSHC1 nur sehr gering katalysiert wurde, wurde eine gute Aktivität gegenüber der Reaktion von Homofarnesol zu Ambroxan ermittelt. Alle anderen beschriebenen Substrate wurden in geringen, aber signifikanten Raten umgesetzt. Ein vollkommen anderes Aktivitäts-Muster wurde bei Umsetzungen mit AacSHC erhalten. Hier wurde neben sehr guter Umsetzung von Squalen eine viel geringere Aktivität gegenüber allen anderen Substraten bestimmt. Vom Enzym ZmoSHC2 wurden nur Squalen und Farnesylaceton mit sehr geringer Aktivität als Substrate akzeptiert, alle anderen Substrate wurden nicht umgesetzt. Anhand dieser Ergebnisse kann gefolgert werden, dass SHCs als vielseitige Biokatalysatoren für komplexe Zyklisierungsreaktionen verwendet werden können, da diese Enzyme eine unerwartete Substrataktivität mit anderen Substraten als Squalen zeigen. In der vorliegenden Arbeit werden diese und weitere Ergebnisse im Detail beschrieben. Neben der erwähnten Untersuchung der Aktivität der verschiedenen SHCs gegenüber unterschiedlichen Substraten wurden auch Mutanten hergestellt und untersucht, die zu einer Erklärung der Aktivitätsunterschiede zwischen den verschiedenen Squalen-Hopen Zyklasen verhelfen sollten. Diese Charakterisierung der Triterpen Zyklasen und die Diskussion ihrer besonderen Eigenschaften führen zu neuen Schlussfolgerungen über das Potenzial von SHCs, als fähige Biokatalysatoren für noch nie gezeigte Reaktionen eingesetzt werden zu können.