Challenges in biocatalysis - case studies on protein expression, engineering and application

Abstract

Biotechnology is emerging as a key technology in the 21st century. In the past years, scientific and technological advances have established the field of biocatalysis as a competitive alternative to traditional metallo- and organocatalysis in chemical synthesis. Yet many, often basic challenges remain in the key steps of biocatalytic processes, which include the biocatalyst production, characterization, engineering, and application as well as down-stream processing. In the scope of this thesis, three case studies were performed to illustrate solutions for selected, critical challenges in these key steps. The first case study featured dirigent proteins, which are involved in the stereoselective control of the first step of lignan biosynthesis, the phenoxyl radical coupling of coniferyl alcohol radicals to yield optically pure (+)- or (-)-pinoresinol. Up to now, extraction of dirigent proteins from plant material or expression in plant and insect cell culture systems resulted in low yields. The metylotrophic yeast Pichia pastoris was evaluated as a possible host for recombinant protein expression. A reliable high yield fed-batch fermentation process with Pichia pastoris resulting in 47 mg mL-1 of the dirigent protein AtDIR6 representing a more than 250-fold increase compared to other sources was established. Biochemical characterization of AtDIR6 produced with Pichia pastoris showed an overall agreement in protein structure, N-glycosylation sites, and dirigent activity compared to AtDIR6 produced by plant cell cultures of Solanum peruvianum, validating Pichia pastoris as a suitable expression system for dirigent proteins. Enzymatic deglycosylation of the protein induced conformational changes leading to the loss of function and subsequent protein aggregation. This demonstrated that the glycan structures of AtDIR6 are essential for structure, solubility, and function of the protein. The second case study focused on a ribokinase from Saccharomyces cerevisiae, which was engineered for an altered substrate spectrum by rational protein design. The enzyme was produced in high yields in a heterologous expression system using Escherichia coli as host and biochemically characterized for the first time. Optimum reaction conditions were investigated regarding the dependency on mono-, di-, and pentavalent ions and the pH. Conditions featuring 100 mM potassium phosphate at pH 6.0 with 2.5 mM magnesium chloride were found to offer the highest catalytic activity. Based on a family alignment and rational design using a homology model of the protein, a small focused library of the ribokinase featuring 72 variants was established. The library was evaluated for alterations in the substrate spectrum with a focus on D-xylose, which is an epimer to the natural substrate D-ribose. More radical alterations such as triple and quadruple mutations abolished catalytic activity towards D-ribose and D-xylose almost completely. Several variants were identified broadening the substrate spectrum to other tetroses, pentoses, and hexoses, albeit with low catalytic efficiency. A single variant exhibited about twice the activity of the wild-type enzyme towards D-xylose (0.77 s-1 versus 0.38 s-1), which can serve as a basis for further studies. In this regard, an attempt to solve a crystal structure for more information about D-xylose binding in the active site was started. While several well diffracting crystals were obtained, molecular replacement did not lead to a solution of the structure so far. The third case study featured a cutinase from the ascomycete Humicola insolens, which was applied as a novel biocatalyst for the synthesis of functionalized acrylic esters by transesterification. The transesterification of methyl acrylate with 6-mercapto-1-hexanol at a high molar ratio in a solvent free system was studied. The enzyme was employed in immobilized form on a microporous, polystyrenic resin to facilitate the usability and stability in a non-aqueous environment and allow simple recovery of the biocatalyst. Besides two minor by-products, 6-mercapothexyl acrylate ester was identified as the main product with the thiol as the functional end group. By optimization of the reaction conditions and critical water content, the transesterification yielded 95.4 ± 0.3% of 6-mercaptohexyl acrylate ester after 6 h at 40°C in the presence of 0.025% (w/w) water without formation of by-products in a solvent free system. When applying methyl methacrylate as an acyl acceptor, transesterification with 6-mercapto-1-hexanol was significantly lower (43.6 ± 0.1%).

Die grundlegenden Schritte eines biokatalytischen Prozesses umfassen sowohl die Produktion, die Charakterisierung, die Optimierung, die Anwendung sowie die Wiederverwertung von Biokatalysatoren als auch die Aufarbeitung der Produkte. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden ausgewählte, kritische Herausforderungen in diesen Schlüsselschritten in drei Fallstudien näher untersucht. Dirigierende Proteine sind in der stereoselektiven Kontrolle des ersten Schrittes in der Lignan Biosynthese beteiligt. In einem Radikalkupplungsschritt werden zwei Koniferylalkoholradikale unter Beteiligung von dirigierenden Proteinen so verknüpft, dass optisch reines (+)- bzw. (-)-Pinoresinol entsteht. Bisher wurden Dirigierende Proteine in geringen Ausbeuten durch Extraktion aus Pflanzenmaterial oder durch heterologe Expression in pflanzlichen Zellkulturen sowie Insektenzellkulturen gewonnen. Die Hefe Pichia pastoris wurde als möglicher Expressionswirt für die rekombinante Proteinproduktion evaluiert. Mit Pichia pastoris konnte ein zuverlässiger Fed-Batch Fermentationsprozess etabliert werden, welcher in Ausbeuten von 47 mg mL-1 des dirigierenden Proteins AtDIR6 resultierte. Dies entspricht einer ca. 250-fachen Steigerung der Ausbeute verglichen mit den bisherigen Systemen. Die biochemische Charakterisierung von AtDIR6, welches mit Pichia pastoris hergestellt wurde, zeigte eine vergleichbare Proteinstruktur und dirigierende Aktivität sowie eine Glykosylierung an den gleichen N Glykosylierungsstellen im Vergleich zu AtDIR6 aus einem heterologen Pflanzenzellsystem (Solanum peruvianum). Diese Ergebnisse bestätigten die Verwendung von Pichia pastoris als geeigneter Expressionswirt für die Herstellung dirigierender Proteine. Eine enzymatische Deglykosylierung des Proteins induzierte strukturelle Veränderungen, welche zu einem Verlust der Funktion und anschließender Proteinaggregation führten. Dadurch konnte die essentielle Bedeutung der Glykanstrukturen von AtDIR6 für die Proteinstruktur sowie die Löslichkeit und Funktion des Proteins demonstriert werden. In der zweiten Fallstudie wurde eine das Substratspektrum einer Ribokinase aus Saccharomyces cerevisiae durch rationales Proteindesign verändert. Das Enzym konnte zum ersten Mal in hoher Ausbeute mit Escherichia coli als heterologer Expressionswirt hergestellt und biochemisch charakterisiert werden. Die optimalen Reaktionsbedingungen bezüglich der Abhangigkeit des Enzyms von mono-, di- und pentavalenten Ionen als auch dem pH Wert wurden ermittelt. Dabei zeigte das Wildtyp Enzym die höchste katalytische Aktivität in 100 mM Kaliumphosphatpuffer bei pH 6.0 mit 2,5 mM Magnesiumchlorid. Basierend auf einem Sequenzvergleich von 200 Ribokinase Sequenzen aus der Familie der Ribokinasen und rationalem Proteindesign mit einem Homologiemodell des Proteins konnte eine kleine, fokussierte Mutantenbibliothek erstellt werden. Die fokussierte Bibliothek wurde in Bezug auf Veränderungen im Substratspektrum evaluiert. Dabei lag der Fokus auf D-Xylose, welches ein Epimer zu dem natürlichen Substrat D-Ribose ist. Starke Veränderungen der Substratbindetasche durch dreifach und vierfach Mutationen führten zu einem nahezu vollständigen Verlust der katalytischen Aktivität gegenüber D-Ribose und D-Xylose. Mehrere Varianten zeigten ein erweitertes Substratspektrum mit geringen Aktivitäten gegenüber Tetrosen, Pentosen und Hexosen. Eine einzelne Variante wies eine etwa verdoppelte Aktivität im Vergleich zu dem Wildtyp Enzym gegenüber D-Xylose auf (0.77 s-1 gegenüber 0.38 s-1), was als Basis für weitere Studien verwendet werden kann. In der dritten Fallstudie wurde eine Cutinase aus dem Schlauchpilz Humicola insolens als neuartiger Biokatalysator für die Synthese von funktionalisierten Acrylestern eingesetzt. Dabei wurde als Modellreaktion die Transesterifizierung von Methylacrylat mit 6-Mercapto-1-hexanol in einem lösungsmittelfreien System untersucht. Das Enzym wurde auf mikroporösem Trägermaterial aus Polystyren immobilisiert um die Verwendbarkeit und Stabilität in einer nicht-wässrigen Umgebung sowie das einfache Wiederverwenden des Biokatalysators zu ermöglichen. Als Hauptprodukt wurde ausschließlich 6 Mercaptohexylacrylatester mit der freien Thiogruppe als funktionelle Endgruppe identifiziert. Die Bildung zweier Nebenprodukte, welche durch Michael-Additionsreaktionen entstanden waren, konnte durch die Optimierung der Reaktionsbedingungen verhindert werden. Die optimierte Transesterifizierung erreichte den Umsatz von 95,4 ± 0,3 % zu dem Hauptprodukt 6-Mercaptoacrylatester in 6 h bei 40°C in der Anwesenheit von 0,025 % (w/w) Wasser in einem lösungsmittelfreien System. Die Verwendung von Methylmethacrylat als Acyl-Akzeptor in einer Transesterifizierung mit 6-Mercapto-1-hexanol lieferte einen deutlich geringeren Umsatz zum entsprechenden Hauptprodukt (43,6 ± 0,1%).