Enzymatischer Zugang zu mittelkettigen Dicarbonsäuren

Abstract

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit einem alternativen biotechnologischen Zugang zu den interessanten Polymerbausteinen Azelainsäure und Sebacinsäure. Ausgehend von Linolsäure wird Azelainsäure in einer dreistufigen Multienzymkaskade hergestellt, welche auf dem pflanzlichen Oxylipinmetabolismus basiert. Die oxidative Spaltung wird durch eine 9-Lipoxygenase (St-LOX1, Solanum tuberosum) eingeleitet, welche Linolsäure mit molekularem Sauerstoff hydroperoxidiert. In einer Folgereaktion wird das entstandene 9-Hydroperoxid durch eine 9/13-Hydroperoxid-Lyase (Cs-9/13HPL, Cucumis sativus) in ein Aldehyd und eine 9-Oxosäure gespalten. In einem letzten Aldehyd-Dehydrogenase (As-ALDH1, Acinetobacter Stamm M-1) katalysierten Schritt wird die 9-Oxosäure 9-Oxononansäure zu Azelainsäure oxidiert. Der hierauf basierende entwickelte E. coli Stamm konnte, in einer Eintopfreaktion Linolsäure direkt zu Azelainsäure umzusetzen (29 mg/mL innerhalb von 8 h). Für die Herstellung von Sebacinsäure wurde mittels einer retrosynthetischen Analyse eine vierstufige artifizielle Multienzymkaskade, ausgehend von Ricinolsäure, entwickelt. Die zentrale C-C-Bindungsspaltung dieser Kaskade erfolgt durch eine de novo Retro-Aldolase (RA 110.4, Arzeda) katalysierte Reaktion. Das für diese Reaktion benötigte 1,3-Ketolmotiv wird zuvor in einer zweistufigen Enzymkaskade bereitgestellt. In einem ersten Schritt wird Ricinolsäure mittels einer Alkohol-Dehydrogenase (ADH-102, c-LEcta) zu 12-Oxoölsäure oxidiert und anschließend mit einer Oleat-Hydratase (Em-OAH1, Elizabethkingia meningoseptica) zu 10-Hydroxy-12-oxostearinsäure umgesetzt. Die durch die Retro-Aldolreaktion entstehende 10-Oxodecansäure wird in einem letzten Schritt analog zu der Oxidation von 9-Oxononansäure mithilfe einer Aldehyd-Dehydrogenase (As-ALDH1, Acinetobacter Stamm M-1) zu Sebacinsäure oxidiert. Die in vitro Multienzymkaskade konnte innerhalb von 26 h mit einer Gesamtausbeute von 10 % durchgeführt werden.

The thesis at hand addresses the establishment of new biotechnological routes, which enable alternative access to the desired monomeric building blocks azelaic and sebacic acid. Azelaic acid is produced from linoleic acid by a three-step multi-enzymatic cascade reaction, which is based on the plant oxylipin metabolism. The oxidative cleavage of linoleic acid is initialized by a 9-lipoxygenase (St-LOX1, Solanum tuberosum), which introduces molecular oxygen to generate a hydroperoxy moiety. In the second reaction the nascent hydroperoxide is cleaved by a 9/13-hydroperoxide lyase (Cs-9/13HPL, Cucumis sativus) in an aldehyde and an 9-oxoacid. In a last aldehyde dehydrogenase (As-ALDH1, Acinetobacter sp. M-1) catalyzed step 9-oxononanoic acid is oxidized to azelaic acid. An E. coli whole cell system, based on the developed pathway, was able to directly convert linoleic acid to azelaic acid (29 mg/mL within 8 h). For the production of sebacic acid a retro-synthetic analysis was performed, which led to an artificial four-step multi-enzymatic cascade starting from ricinoleic acid. The central C-C cleavage reaction is hereby performed by a retro-aldolase (RA 110.4, Arzeda) catalyzed reaction. The necessary 1,3-ketol motif for the retro-aldol cleavage is formed beforehand by two enzyme catalyzed reactions. In a first step ricinoleic acid is oxidized by an alcohol dehydrogenase (ADH-102, c-LEcta) and subsequently converted to 10-hydroxy-12-oxostearic acid by the action of an oleate hydratase (Em-OAH1, Elizabethkingia meningoseptica). 10-oxodecanoic acid, which emerges out of the retro-aldol reaction, is oxidized in a last step by an aldehyde dehydrogenase (As-ALDH1, Acinetobacter sp. M-1) to sebacic acid. The whole in vitro four-step enzymatic cascade could be performed within 26 h with an overall yield of 10 %.