Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.18419/opus-14911
Authors: Beigl, Tobias B.
Title: Brought to light: the Bcl-2 transmembrane domain interactome elucidated by a bimolecular split luciferase assay and its impact on apoptosis signalling
Issue Date: 2024
metadata.ubs.publikation.typ: Dissertation
metadata.ubs.publikation.seiten: XVI, 224
URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-ds-149304
http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/14930
http://dx.doi.org/10.18419/opus-14911
Abstract: Apoptose ist eine Form des programmierten Zelltods, die häufig bei verschiedenen Krankheiten wie Krebs gestört ist. Ein Schlüsselereignis der Apoptose ist die Permeabilisierung der äußeren Mitochondrienmembran (MOMP), die von der B-Zell-Lymphom 2 (Bcl-2) Proteinfamilie gesteuert wird. Bcl-2-Proteine bilden ein komplexes Interaktionsnetzwerk, in dem sich pro- und anti-apoptotische Mitglieder gegenseitig zugunsten von Zelltod oder -Überleben hemmen. Das Netzwerk wird durch die Interaktion zwischen dem Bcl-2 Homologie 3 Motiv (BH3) und der hydrophoben Furche definiert. Eine neue Art von niedermolekularen Wirkstoffen, sogenannte BH3-Mimeticka, welche die hydrophobe Furche anti-apoptotischer Bcl-2 Proteine besetzen, ist wirksam in der Krebstherapie. Es verdichten sich jedoch Hinweise darauf, dass die weit weniger untersuchte C-terminale Transmembrandomäne (TMD) von Bcl-2 Proteinen, die traditionell als Membrananker fungiert, ebenfalls als Interaktionsfläche dienen kann. Zur weiteren Aufklärung der Interaktionen in der Bcl-2-Proteinfamilie über die TMD wurde ein zellbasierter Assay entwickelt und validiert, bei dem das mit TMDSequenzen fusionierte bimolekulare Luziferase-System NanoBiT mit gleichzeitiger Expression von Fluorophoren zur Signalnormalisierung kombiniert wird. Eine systematische Analyse der TMD-Interaktionen zwischen pro-apoptotischen Effektor-Bcl-2-Proteinen (BAX, BAK und BOK) und anti-apoptotischen Bcl-2-ähnlichen Proteinen (BCL-2, BCL-XL, BCL-W, MCL-1 und A1) offenbarte homotypische Interaktionen zwischen Effektor-TMDs und Interaktionen von Effektor-TMDs mit BCL-XL-TMD und BCL-W-TMD. Interessanterweise wurde eine bisher unbekannte Interaktion von BOK-TMD und BCL-2-TMD identifiziert. Die subzelluläre Lokalisierung Fluorophor-konjugierter TMD-Peptide verdeutlichte, dass einige TMDs präferentiell in Mitochondrien (BAX, BAK, BCL-XL, BCL-W) lokalisiert sind, während andere (BOK, BCL-2, MCL-1) vorwiegend mit dem endoplasmatischen Retikulum (ER) kolokalisiert sind. TMD-Austausch und Mutation in BAX bestätigten eine wichtige Rolle der BAX-TMD bei der BAX-Inhibition, während der TMD-Austausch in BAK einen vernachlässigbaren Einfluss auf die BAK-Regulierung durch BCL-2 hatte. Darüber hinaus hingen sowohl die Kolokalisierung von BOK und BCL-2 als auch die Hemmung des durch BOK-Überexpression induzierten Zelltods durch BCL-2 von den TMD Sequenzen ab. Dementsprechend modulierte TMD-Mutation von BCL-2 die Interaktion mit BOK-TMD, die subzelluläre Lokalisierung und die anti-apoptotische Kapazität von BCL-2. Letztlich steigerte die Abwesenheit von BCL-2 den BOK-abhängigen ER-Stress-induzierten Zelltod, was auf einen physiologischen Kontext für die funktionelle Bedeutung ihrer TMD-Interaktion hinweist. Somit hebt diese Arbeit hervor, dass die Aufklärung des Bcl-2-TMD-Interaktoms für unser Verständnis der Apoptose-Regulation wichtig ist und ebnet den Weg für zukünftige Untersuchungen der TMD als Ziel für klinische Interventionen.
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