Monoclonal and recombinant antibodies to potyviral proteins and their application

Abstract

Ziel war es, Variable-Fragment-Einzelketten-Antikörper (scFv) gegen konservierte Aminosäuremotive der RNA-abhängigen RNA-Polymerase von Potyviren zu gewinnen. Die Expression der scFv-Gene in Pflanzen ist ein Weg zur Gewinnung von Kulturpflanzen, die resistent gegen Potyvirus-Infektionen sind. Die scFv könnten Anwendung bei der Diagnose von Potyviren finden. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1. Vier monoklonale Antikörper (MAb), die gegen synthetische Peptide, die zwei der drei hochkonservierten Regionen des Kerneinschlussproteins b (NIb) von Potyviren widerspiegeln, gewonnen wurden, reagierten mit verschiedenen Potyviren. 2. Die Sequenz des NIb des potato Y potyvirus (PVY) sowie für eine synthetisches Protein, das aus einer Fusion aller drei hochkonservierten NIb-Regionen besteht, wurde in E. coli überexpremiert. Sie wurden für die Testung der Reaktivität der MAb genutzt. Das überexpremierte NIb wurde als Antigen für die MAb-Gewinnung eingesetzt. 3. MAb gegen das rekombinante NIb sowie das Hüllprotein (CP) des PVY wurden hergestellt. Es wurde gezeigt, dass sie PVY-Infektionen nachweisen können. Besonders der NIb-spezifische MAb 2E11 ist gut für diesen Nachweis geeignet. 4. Die Dynamik der Expression des CP und NIb des PVY in infizierten Nicotiana glutinosa und N. occidentalis wurde untersucht. Beide Proteine konnten in systemisch infizierten Blättern ab 5 dpi nachgewiesen werden. 5. ScFv-Antikörper gegen CP und NIb wurden aus Hybridomazellen, die MAb sekretierten, hergestellt. Die Expression des scFv 1D6F1, spezifisch für das PVY CP, erreichte ein Maximum von 17 vom gesamten löslichen Protein in E. coli. 6. Sowohl Phagen- als auch lösliche scFv-Antikörper zeigten ähnliche Bindungsaffinitäten mit den Ziel-Antigenen. Die Nachweisempfindlichkeit mit scFv war geringer als mit den Ausgangs-MAb. 7. ScFv-alkalische Phosphatase (AP) Fusionsproteine wiesen eine geringe Sensitivität auf, wahrscheinlich bedingt durch die niedrige enzymatische Aktivität der bakteriellen AP.

The objective of this work was to engineer single chain variable fragment antibodies (scFvs) to highly conserved aa motifs of the RNA-dependent RNA polymerase of potyviruses (RdRp). The expression of scFv genes in plants holds great promise to create novel resistant crops against potyviral infections. The following results were obtained: 1. Four monoclonal antibodies (MAbs) obtained from synthetic peptides covering two of the three highly conserved regions of the nuclear inclusion b protein (NIb) of potyviruses reacted with the NIb of several potyviruses in both Western blot and ELISA. 2. The sequence encoding for the NIb of potato Y virus (PVY) as well as for a synthetic protein, consisting of a fusion of all three highly conserved NIb regions, was overexpressed in and purified from Escherichia coli near to homogeneity by immobilized metal-ion affinity chromatography. The fusion proteins were used to test the reactivity of MAbs. The overexpressed NIb was used as an antigen for MAb production. 3. MAbs to the recombinant NIb as well as to the coat protein (CP) of PVY were obtained. It was demonstrated that they can be used to detect PVY infection. 4. Dynamics of the expression of CP and NIb in PVY-infected Nicotiana glutinosa and N. occidentalis plants was systematically investigated. Both proteins could be detected in systemically infected leaves from the fifth day post infection on by ELISA and Western blotting. 5. ScFv antibodies were generated against CP and NIb from hybridoma cells secreting MAbs. Expression of scFv 1D6F1, specific for the PVY CP, reached a maximum of 17 of total soluble proteins in E. coli. 6. Both phage-displayed and soluble scFv showed a similar binding affinity to the target antigens. The detection sensitivity using scFv was lower than that of the parental MAb. 7. ScFv-alkaline phosphatase (AP) fusion proteins only showed low sensitivity, probably, due to the low enzymatic activity of the bacterial AP.