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Authors: Gutjahr, Thorsten S.
Title: Neuartige retrovirale Vektorsysteme für die Gentherapie: Entwicklung in Suspension wachsender Verpackungszellinien
Other Titles: New retroviral vector systems for gene therapy: development of packaging cell lines growing in suspension
Issue Date: 2000
metadata.ubs.publikation.typ: Dissertation
URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-6013
http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/1509
http://dx.doi.org/10.18419/opus-1492
Abstract: Mit den zur Zeit verfügbaren adhärenten Verpackungszellinien ist die Produktion retroviraler Vektoren sehr begrenzt. Das Ziel dieser Arbeit war es, retrovirale Verpackungszellinien zu entwickeln, die in Suspension wachsen und ein 'scale-up' der Vektorproduktion ermöglichen. Es wurde gezeigt, daß Suspensionszellinien fähig sind Retrovirusvektoren transient zu produzieren, doch aufgrund ihrer schlechten Transfizierbarkeit es schwierig ist, eine genügend hohe und stabile Expression der viralen Strukturproteine, sowie des rekombinanten Virusgenoms zu erzielen. Aus diesem Grund wurden adhärente Verpackungszellinien an Suspensionswachstum adaptiert. Dazu wurde eine sichere und hoch effiziente HEK293-Verpackungszellinie hergestellt. Diese sowie die HT1080 abgeleitete FLYA13 wurden unter Verwendung serumfreier Medien an Suspensionswachstum adaptiert. Die in Suspension wachsenden Zellinien waren weiterhin fähig Virusvektoren zu produzieren, wobei die FLYA13- sehr hohe, die HEK293-Suspensionsverpackungszellinie niedrigere Virustiter erzielten. Es wurde gezeigt, daß diese Unterschiede zum Teil auf den verwendeten Medien beruhten. Durch Verwendung optimierter Medien und Kulturbedingungen sollte daher eine Steigerung der Vektorproduktion möglich sein. Neben der Herstellung von Suspensionsverpackungszellinien wurden Studien zum Verhalten von Verpackungszellinien in Langzeitkultur durchgeführt. Es wurde gezeigt, daß eine Verpackungszellinie im Laufe der Kultivierung immer mehr Kopien an Provirusintegraten hinzubekommt. Die Vermehrung der rekombinanten Provirusintegrate könnte durch retrovirale Mechanismen innerhalb der Zelle und/oder auf Reinfektionen der Produzentenzellen mit den von ihr selbst gebildeten rekombinanten Virusvektoren beruhen. Das solche Reinfektionen möglich sind, wurde in mehreren Experimenten demonstriert. Weiterhin wurde eine Abnahme der Virusproduktionsleistung einer retroviralen Verpackungszellkultur im Laufe einer Langzeitkultivierung festgestellt.
Using currently available adherent packaging cell lines the production of retroviral vectors is highly limited. We aimed to develop retroviral packaging cell lines growing in suspension, thus having a high scale-up potential. First, we demonstrated that suspension cell lines are able to produce retroviral vectors transiently. However, the poor efficiency of transfection of suspension cells renders a high and stable expression of the viral proteins and of the recombinant vector genome difficult. To this end, adherent packaging cell lines were adapted to suspension growth. We established a safe and high efficient HEK293 packaging cell line. This as well as the HT1080-based FLYA13 packaging cell line were adapted to suspension growth using serum-free media. The suspension cell lines were still able to produce viral vectors. The titers of the FLYA13-derived packaging cell lines were high, whereas the HEK293-derived were lower. This decrease could be attributed in part to the suspension media used. Therefore, optimized media and culture conditions should further increase the vector production. Beside the development of suspension packaging cell lines long-term studies on packaging cell lines were conducted. We showed an increase of proviral integrates in packaging cell lines over culture time. This could be due to a yet unknown mechanism within these cells or due to reinfection events of the cells with their self-produced vectors. The existence of such reinfections was shown in several superinfection experiments. Furthermore, we demonstrated that the vector production of retroviral packaging cell lines decrease over culture time.
Appears in Collections:04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik

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