Untersuchungen zu invasionspezifischen Proteinen von Holospora obtusa, einem Bakterium aus dem Makronukleus von Paramecium caudatum

Abstract

H.obtusa ist ein endonukleäres, Gram-negatives Bakterium, das ausschließlich den Makronukleus von Paramecium caudatum infiziert und dort lebt. Ziel war es, infektionsrelevante Proteine von Holospora obtusa zu finden und zu untersuchen. Es wurden Wechselwirkungen zwischen einem 51,5 kDa Oberflächenproteinen von H. obtusa und einem 67 kDa phagosomalen Protein von P. caudatum gefunden. Das Gen des 51,5 kDa Proteins wurde sequenziert und mit anderen Proteinen aus Datenbanken verglichen. Es zeigte Sequenzübereinstimmungen mit Proteinen aus human- und pflanzenpathogenen Bakterien, deren gemeinsames Grundmuster auf die Fähigkeit, Zuckerreste auf Oberflächenstrukturen zu erkennen, hindeutet. Ein 15,5 kDa Protein, das Periplasma der infektiösen Bakterien vorliegt, verschwindet während der Infektion von dort. Es wurde mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese und einem monoklonalen Antikörper isoliert werden. Die Analyse des Gens ergaben ein saures Protein, dem ein Signalpeptid aus 21 Aminosäuren voraus geht. Ähnliche Aminosäuresequenzen konnten in Datenbanken bisher nicht gefunden werden. Die Expression erfolgte mit dem pET38b(+) Plasmid in E. coli. Die Holospora Signalsequenz des 15,5 kDa wurde von E. coli zumindest nicht korrekt erkannt, was zu Protein-Konglomeraten im Zytoplasma führte. Basierend auf der DNA-Sequenz des 15,5 kDa Proteins wurden Fluoreszenz-markierte DNA-Oligonukleotide hergestellt und die mRNA mit der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung in H. obtusa nachgewiesen. In infektiösen Formen konnte keine mRNA des Gens nachgewiesen werden, wogegen in reproduktiven Formen und in Zwischenstufen deutliche Mengen an transkripierter mRNA vorlagen. Dies lässt eine kontrollierte zeitliche Trennung von Transkription und Translation vermuten.

The target of this thesis was to find proteins which are involved in the invasion of the macronucleus of the ciliate Paramecium caudatum by the endonuclear bacterium Holospora obtusa. Interactions between surface proteins of H. obtusa and P. caudatum were observed. A 51,5 kDa protein of H. obtusa and a 67 kDa protein of P. caudatum were found to be potential binding partners connecting the inner membran of the phagosomes and the outer surface of H. obtusa. The open reading frame of the 51,5 kDa protein show similarities to some proteins of human- and plant-pathogenic bacteria. These proteins possess the ability to bind and react with carbonhydrate structures indicating a lectin function of the 51,5 kDa protein. Another focus was set on a 15.5 kDa protein, which was mainly observed in the periplasm of the bacteria. The 15.5 kDa protein and its corresponding DNA were analyzed showing an acidic protein, which is preceded by a signal peptide of 21 amino acids. No related protein or DNA sequence could be found in databases. The 15.5 kDa protein was expressed in E. coli using the pET38b(+) system. The signal peptide of H. obtusa was obviously not recognized by E. coli, which was causing the inclusion bodies inside the zytoplasm of E. coli. Furthermore, some dye labelled DNA oligonucleotides were used to detect gene-specific mRNA by using the fluorescent in situ hybridisierung. A stage dependent transcription was observed, limited to the reproductive and intermediate form of H. obtusa. However, no gene specific transcript could be observed in infectious or activated forms. It is assumed that transcription started in the reproductive form, continuing in the inactive infectious form. Whereas the translation of the transcripts is limited to the intermediate and early infectious form.