Termination der Mitose: die Rolle der Phosphatase Cdc14 beim M/G1-Übergang in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Hauptregulatoren des eukaryotischen Zellteilungszyklus sind die zyklinabhängigen Kinasen (CDKs). Die koordinierte Aktivierung und Inaktivierung dieser Kinasen ermöglicht der Zelle das Voranschreiten im Teilungszyklus. Die Regulation der zyklinabhängigen Kinasen erfolgt im wesentlichen auf zwei Wegen. Zum einen fluktuieren die Mengen der positivregulatorsichen Zyklin durch zellzyklusabhängige Transkription und Degradation. Zum anderen werden die CDKs durch die Bindung von Inhibitoren an die Zyklin-CDK Komplexe inaktivert. Ein wichtiger Schritt im Zellteilungszyklus ist die Beendigung der Mitose und der damit verbundene Übergang in die nächste G1 Phase. Für diesen Vorgang ist die vollständige Inaktivierung aller zyklinabhängigen Kinasen essentiell. Ein Signaltransduktionsnetzwerk - das mitotic exit network MEN - reguliert diesen Prozess. Komponenten des MEN sind neben anderen die Kinasen Cdc15 und Cdc5 sowie die Phosphatase Cdc14. Haupteffektor dieses Signaltransduktionsnetzwerkes ist Cdc14. Diese Phosphatase wirkt antagonistisch zur zyklinabhängigen Kinase und dephosphoryliert viele Substrate der CDK. Die Phosphatase Cdc14 erlaubt somit den Zellen den Übertritt in den nächsten Zellzyklus. Ziel der Arbeit war es, die Aufgaben und die Regulation der Phosphatase Cdc14 zu untersuchen. Es wurde gefunden, dass Cdc14 ein genereller Aktivator der Proteindegradation am Ende der Mitose ist. Diese wird durch den Ubiquitinligasekomplex APC (anaphase promoting complex) vermittelt. Erhöhte Mengen an Cdc14 führen zum Abbau der Zykline Clb2, Clb3 und Clb5. Verantwortlich dafür ist die Cdc14-abhängige Dephosphorylierung des APC-Substratspezifitätsfaktor Hct1. Cdc14 ist hier der Gegenspieler der zyklinabhängigen Kinase, die Hct1 durch Phosphorylierung inaktiv hält. Cdc14 ist somit ein geschwindigkeitsbestimmender Faktor für die Inaktivierung der mitotischen CDKs am Ende der Mitose durch Proteolyse der positiv regulatorischen Zykline. Weiterhin beeinflusst Cdc14 einen zweiten Weg zur Inaktivierung der zyklinabhängigen Kinase am Ende der Mitose. Cdc14 aktiviert den Inhibitor zyklinabhängiger Kinasen Sic1 sowohl transkriptionell als auch posttranslational. Ein weiteres Substrat für die Phosphatase Cdc14 ist die MEN-Kinase Cdc15. Cdc15 ist Teil des MEN und selbst an der Aktivierung von Cdc14 beteiligt. Aktiviertes Cdc14 seinerseits dephosphoryliert Cdc15 und beeinflusst dadurch dessen Lokalisierung an den Spindelpolen. Die Spindelpollokalisierung von Cdc15 ist wichtig für den korrekten Ablauf der Zytokinese. Cdc14 ist somit ebenso wie viele andere MEN-Komponenten auch an der Regulation der Trennung von Mutter- und Tochterzelle beteiligt. Neben der Untersuchung der Aufgaben von Cdc14 war auch die Regulation von Cdc14 selbst ein Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Zuerst wurde die Möglichkeit der Regulation von Cdc14 durch die zyklinabhängige Kinase untersucht. Viele Regulatoren des Zellteilungszyklus stehen unter direkter Kontrolle der CDK. Es wurde gefunden, dass Cdc14 ein in vitro Substrat für die zyklinabhängige Kinase ist. Die Entfernung aller potentiellen Phosphorylierungsstellen in Cdc14 für die zyklinabhängige Kinase ergab, dass unter Umständen die Phosphorylierung an zwei Positionen im nicht essentiellen C-Terminus von Cdc14 zu einer Aktivierung von Cdc14 beitragen kann. Im weiteren konnte gezeigt werden, dass die Polokinase Cdc5 die Aktivierung von Cdc14 bewirkt. Nach einem gängigen Modell wird die Aktivität von Cdc14 durch seine Lokalisierung im Nucleolus reguliert. Die Phosphatase wird dort von ihrem Inhibitor Net1 während der meisten Zeit des Teilungszyklus verankert und inaktiv gehalten. Erst zu Beginn der Anaphase wird Cdc14 aus dem Nucleolus freigesetzt und dadurch aktiviert. Es wurde gefunden, dass hohe Mengen an Cdc5 zur Freisetzung von Cdc14 aus dem Nucleolus und zum Verlust der Interaktion mit dem Inhibitor Net1 führen. Weitere Untersuchungen zeigten, dass Cdc14 und sein Inhibitor Net1 während der Anaphase phosphoryliert werden. Die weitere Untersuchung ergab, dass beide Proteine Substrate für Cdc5 in vitro sind und ihre Phosphorylierung in vivo von funktioneller Polokinase abhängt. Cdc5 ist folglich ein Aktivator der CDK-antagonistischen Phosphatase Cdc14. Aufgrund der geschilderten Ergebnisse und der Literaturdaten wird vorgeschlagen, dass Cdc14 durch Cdc5-vermittelte Phosphorylierung und zusätzlich mit Hilfe anderer Komponenten des MEN aktiviert wird. Dies führt auf zwei Wegen zur Beendigung der Mitose. Zum einen aktiviert Cdc14 den APC durch Dephosphorylierung von Hct1 und löst somit die Degradation mitotischer Zykline aus. Zum anderen stabilisiert Cdc14 den Inhibitor Sic1 und inaktiviert dadurch die zyklinabhängige Kinase. Die Aktivierung von Cdc14 ist demnach der geschwindigkeitsbestimmende Schritt beim Übergang von der M Phase in den nächsten Teilungszyklus.

The cyclin dependent kinases (CDKs) are key regulators of the eukaryotic cell cycle. Coordinated activation and inactivation of these kinases is essential for the progression through the cell cycle. Regulation of the cyclin dependent kinase is achieved by two mechanisms. First, cyclin levels are regulated by stage specific transcription and by ubiquitin mediated degradation. Cyclins are the positive regulatory subunits of an active CDK. Second, binding of CDK inhibitors like Sic1 inactivate active CDK complexes. The exit from mitosis is an important cell cycle transition. Downregulating cyclin dependent kinase activity is essential for this process. A signal transduction network - the mitotic exit network MEN - controls the M/G1 transition. Members of this network are among others the kinase Cdc15, the polo-like kinase Cdc5 and the phosphatase Cdc14. Cdc14 is the main target and effector of the MEN. Cdc14 acts as an antagonist to the cyclin dependent kinase and leads to the dephosphorylation of various substrats of the CDK. Therefore, activation of Cdc14 inititates the proteolytic destruction of mitotic cyclins and stabilises the CDK inhibitor Sic1. This leads to the inactivation of the cyclin dependent kinase and allows entry into the next cell cycle. Understanding the function and the regulation of the phosphatase Cdc14 was the intention of this work. It was found, that Cdc14 is a general activator of the protein degradation at the end of mitosis. This protein degradation is controlled by the ubiquitin ligase APC (anaphase promoting complex) and its substrate specificity factor Hct1. High levels of Cdc14 inititate the degradation of the cyclins Clb2, Clb3 and Clb5 in a Hct1 dependent manner. In addition, the anaphase inhibitor Pds1 is unstable under these conditions. Cdc14 promotes the degradation of these proteins by the dephosphorylation of Hct1. Hct1 is under negative control of the cyclin dependent kinase itself. Therefore, Cdc14 is a rate limiting factor for the inactivation of the CDK at the end of mitosis. Additionally, Cdc14 influences a second independent pathway for inactivation of the CDK activity at the end of mitosis. Cdc14 positively regulates the CDK inhibitor Sic1 on a transcriptional and a posttranslational level. This results in an accumulation of Sic1 and the inhibition of the cyclin dependent kinase. Another target of Cdc14 is the MEN kinase Cdc15. Cdc15 is essentially involved in the activation of Cdc14. It was found that activated Cdc14 dephosphorylates Cdc15 and thereby alters the spindle pole body localisation of Cdc15. This altered localisation is important for Cdc15’s function in regulating cytokinesis. Therefore, Cdc14 - like other members of the MEN - is a regulator of cytokinesis. In addition, the regulation of Cdc14 itself was under investigation. Many cell cycle regulators are under control of the cyclin dependent kinase itself. Therefore, a possible regulation of the phosphatase Cdc14 by the CDK was investigated. It was found that Cdc14 is an in vitro substrate for the cyclin dependent kinase. To further analyse this finding, all six potential recognition sites for the CDK in Cdc14 were mutated. The characterisation of this mutant proteins revealed that the phosphorylation of two of these sites located in the non essential C terminal region of Cdc14 may be involved in the activation of this phosphatase. Furthermore, the regulation of Cdc14 by the polo like kinase Cdc5 was shown. According to a recent model, interaction with the phosphatase inhibitor Net1 traps and inactivates Cdc14 in the nucleolus. Release of Cdc14 from the nucleolus during anaphase leads to the activation of this phosphatase. It was found that elevated levels of Cdc5 caused an release of Cdc14 from the nucleolus and a loss of interaction between Cdc14 and Net1. Further analysis revealed that Cdc14 and Net1 get phosphorylated during anaphase. CDC5 overexpression mimicked this phosphorylation. Furthermore, Cdc14 and Net1 are in vitro substrates for Cdc5 kinase and the phosphorylation of both proteins depends on Cdc5 activity. Therefore, Cdc5 is an activator of the CDK antagonistic phosphatase Cdc14. Based on our results and the literature data, we propose that Cdc14 gets activated by Cdc5- dependent phosphorylation in combination with other members of the MEN. Then, Cdc14 promotes exit from mitosis by two mechanisms. First, Cdc14 dephosphorylates Hct1 and therefore promotes Clb2 degradation. Second, Cdc14 stablises Sic1. This is a twofold negative regulation of the CDK. Besides the role of Cdc14 in eliminating CDK activity, Cdc14 influences cytokinesis by dephosphorylating the kinase Cdc15. In summary, Cdc14 is the main effector and the main target of the signal transduction network MEN that regulates the M/G1 transition.