Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.18419/opus-1568
Authors: Hashem Dabaghian, Alireza
Title: Functional knockout of cellular prion protein in mouse neuroblastoma cell by over-expression of anti-prion protein intrabodies
Other Titles: Funktionelle Knockout des zellulären Prion-Proteins in Maus-Neuroblastome-Zellkulturen durch Überexpression von Anti-Prion-Protein Intrabodies
Issue Date: 2002
metadata.ubs.publikation.typ: Dissertation
URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-11062
http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/1585
http://dx.doi.org/10.18419/opus-1568
Abstract: BSE, Scrapie and vCJD are assumed to be caused by prions. Several data show that PrPsc is for pathogenesis and transmission of the prion disease required. It has in transgenic mice been shown, that PrP-Protein is not an essential factor for the surviving of the individuals. These mice, also called PrP 0/0 mice are resistant to develop a neurodegenerative disease, after inoculation with prions. Based upon this finding, a depletion of PrPc could be considered as potential way for therapeutic methods in prion diseases. And anti-PrP intrabodies could potentially have a therapeutic function, for a therapy of vCJD patients. We describe in this work, how via anti-PrP intrabodies (lowering / depletion) of the cellular PrPc-level is caused. Derived from 3 monoclonal antibodies against mouse PrPc, expression cassettes for scFv, containing the coding sequence for the variable domain of heavy and light chain, connected with a peptide linker were constructed. After displaying on phage, they were tested for invitro-binding affinity, and underwent subsequently 2 rounds of panning. The scFv with best binding affinity were selected and the encoding DNA-sequence (expression cassette) was subcloned into a mammalian expression vector. The subcloning rendered a fusion of the scFv-expression-cassette with a retention signal in the ER. Mouse neuroblastoma cells were transfected with this construct and additionally with a mammalian expression vector for mouse PrPc. The experiments revealed an effect between (lowering - depletion) of PrPc-level in the cotransfected cells. The effect was dependent on the amount of transfected scFv. It was increased by higher concentrations of scFv. This effect would be intriguing, if retaining of the PrPc in the ER could stop increasing and spreading the infectivity in Neuroblastoma cells. A big step forward gene therapy would hereby be established.
Mäuse mit homozygoter Zerstörung des Prnp-Gens, welches (PrPc) kodiert, sind lebensfähig und fertil. Solche Mäuse sind andererseits völlig resistent gegen die Infektion mit Prionen. Obwohl die genaue Funktion des zellulären Prion-Proteins nicht definitiv bekannt ist, war es auf diesem Hintergrund interessant zu versuchen, einen „funktionellen Knockout“ des PrPc in Säugerzellkulturen mit Hilfe von anti-PrPc intrabodies zu etablieren. Mit Hilfe geeigneter Fusionssequenzen, sollten diese in Mauszellen exprimiert und in das ER geleitet und dort verankert werden, so dass eine Retention des PrPc während seiner normalen Passage durch das ER erfolgen sollte. Damit sollte sich im Idealfall eine Translokation des PrPc auf die Zelloberfläche verhindern lassen. Da PrPc dort bzw. in einem benachbarten zellulären Kompartiment im Falle eines Kontaktes mit PrPSc als Subtrat für die posttranslationale Entstehung von weiteren PrPsc Molekülen dient ("Konversionsprozess"), könnte damit die Verbreitung der Infektion unterbunden werden. Eine Reihe von monoklonalen Antikörper gegen PrPc waren hergestellt worden. Aus deren Hybridom-Zellen wurden dann die intrabodies hergestellt, und diese wurden dann für Transfektionsexperimente an Maus-Neuroblastomzellen verwendet. Westernblot-Experimente ergaben, dass die intrabodies bei transienter Transfektion in Maus-Neuro2a-Neuroblastomzellen erfolgreich exprimiert wurden. Immunfluoreszenz-Untersuchungen bestätigten die erwartete Lokalisation im Bereich des ER. Die Ko-Transfektion der anti-PrPc-intrabodies mit einem Expressionsvektor für PrPc zeigte, dass die intrabodies, die immundetektierbaren Mengen an PrPc vermindern. Dieser Effekt schien von der Menge des exprimierten Einzelketten-Antikörpers abhängig zu sein. Des weiteren ergaben die Untersuchungen, dass das PrPc sehr wahrscheinlich durch die Bindung von ER-verankerten Einzelkettenantikörpern über den proteasomalen Abbauweg verstärkt degradiert wird.
Appears in Collections:04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
doktorarbeit-revision2.pdf8,1 MBAdobe PDFView/Open


Items in OPUS are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.