Spectinomycin und Netropsin - Biosynthese und Resistenz in den Produzentenstämmen der Gattung Streptomyces

Abstract

Die beiden Antibiotika Spectinomycin und Netropsin werden von verschiedenen Streptomyceten synthetisiert. Einige der Produzentenstämme wurden hinsichtlich ihrer phäno- und genotypischen Eigenschaften näher charakterisiert und verglichen. Dabei konnten zwischen den Stämmen Streptomyces flavopersicus NRRL B-2820, Streptoverticillium baldaccii ATCC19756 und Streptomyces netropsis DSM40093 keine Unterschiede fest-gestellt werden. Für die nachfolgenden Untersuchungen wurde hauptsächlich der Stamm S. flavopersicus NRRL B-2820 herangezogen. Nach einer Optimierung der Kulturbedingungen wurde das Aminoglykosid-Antibiotikum Spectinomycin von S. flavopersicus NRRL B-2820 in hinreichender Menge gebildet. Durch Modifikation bekannter Methoden konnte der Wirkstoff aus den Kulturüberständen des Stammes aufgereinigt und anhand von Agarplatten-Diffusionsassays, Dünnschichtchromatographie und HPLC-Analytik nachgewiesen werden. Ein Problem im Nachweis der Spectinomycin-Produktion stellte die Synthese eines zweiten Antibiotikums dar, das vorher nicht in S. flavopersicus gefunden worden war. Aufgrund der Eigenschaften dieses Wirkstoffs und der Ähnlichkeit von S. flavopersicus NRRL B-2820 mit S. netropsis DSM40259, einem Netropsin-Produzenten, wurde vermutet, dass es sich dabei um das Peptid-Antibiotikum Netropsin handelt. Ein bereits bekannter und sequenzierter Teil des Spectinomycin-Biosynthese-Genclusters von S. flavopersicus NRRL B-2820 diente als Ausgangspunkt, um in einer Genbank nach weiteren Synthesegenen zu suchen. Ein Cosmid mit dem vermeintlich gesamten Biosynthese-Cluster bestehend aus 16 offenen Leserahmen (spcRNTABCDXEYFGHIJK) wurde identifiziert. Über Homologie-Vergleiche und der Suche nach konservierten Regionen konnten den daraus abgeleiteten Proteinen mögliche Funktionen zugeteilt und sie Protein-Familien zugeordnet werden. Danach gibt es einen Transkriptionsregulator, ein Protein für Spectinomycin-Resistenz, ein Transportprotein, eine Monophosphatase, zwei Dehydrogenasen, zwei Aminotransferasen/Dehydratasen, eine Epimerase, eine Keto-Isomerase, eine 4,6-Dehydratase, eine Glykosyltransferase, eine Methyltransferase, eine Thymidylyltransferase, ein Zuckerbinde-protein und ein Protein mit Ähnlichkeit zu Molybdän-Cofaktor-Biosyntheseproteinen. Das Synthese-Cluster wurde mit den bereits bekannten Spectinomycin-Biosynthesegenen aus S. spectabilis NRRL2494 und S. spectabilis NRRL2792 verglichen. Anhand aller verfügbaren Daten konnte ein möglicher Biosyntheseweg für Spectinomycin postuliert werden. Das für die Spectinomycin-Resistenz verantwortliche Enzym in S. flavopersicus NRRL B-2820 und S. spectabilis NRRL2494 ist eine Spectinomycin-Phosphotransferase SpcN. Das Protein aus S. spectabilis wurde in Escherichia coli exprimiert und mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt. Mit Hilfe verschiedener Aktivitätstests wurde festgestellt, dass das Enzym mit ATP spezifisch Spectinomycin und Dihydrospectinomycin phosphoryliert. Eine Inaktivierung anderer Aminoglykosid-Antibiotika so wie eine kompetitive Inhibition des Enzyms durch die Substanzen konnte nicht nachgewiesen werden. Der KM-Wert der Spectinomycin-Phosphotransferase für Spectinomycin betrug etwa 20 µM. Die Gene für die beiden Dehydrogenasen, SpcB und SpcH, aus dem Spectinomycin-Gencluster von S. flavopersicus konnten in E. coli nur in geringer Menge exprimiert werden. Im postulierten Biosyntheseweg von Spectinomycin könnten sie mehrere Oxidations-/Reduktionsreaktionen katalysieren. Mit einigen der möglichen Substrate, myo-Inositol, scyllo-Inosose, Spectinomycin und Dihydrospectinomycin, konnte in in vitro mit NAD(P)+ bzw. NAD(P)H als Coenzym jedoch keine Aktivität festgestellt werden. Die Inaktivierung einiger Biosynthesegene über verschiedene Methoden zeigte keinen Erfolg. Dies lag zum einen daran, dass für S. flavopersicus kein zufriedenstellendes Transformationsprotokoll erstellt werden konnte, und zum anderen daran, dass durch das Fehlen von Sporen die Mutanten inhomogen waren, und in einem Myzel Wildtyp- und mutierte Sequenz parallel vorkamen. Daher konnten die Ansätze zur kombinatorischen Biosynthese, d.h. der Austausch des Methyltransferasegens spcG in S. flavopersicus gegen das Amidinotransferasegen strB1 aus S. griseus, nicht verwirklicht werden. Dagegen führte der umgekehrte Austausch von strB1 gegen spcG in S. griseus zu Mutanten, die keine antibiotische Aktivität mehr aufwiesen. Des Weiteren wurden die Netropsin-Resistenzgene netP1 und netP2 aus S. flavopersicus NRRL B-2820 isoliert. Die daraus abgeleiteten Proteine zeigten Homologie zu ABC-Transportern und wiesen charakteristische Motive dieser Proteine auf, insbesondere eine Transmembran- und eine ATP-Bindedomäne. Verschiedene Mutanten in netP1 und netP2 wurden in unterschiedlichen Tests auf ihre Netropsin-Resistenz untersucht. Aufgrund der Ergebnisse wird postuliert, dass NetP1 und NetP2 als Heterodimer wirken, aber zu einem sehr geringen Teil auch als Homodimer aktiv sind.

Several streptomycetes are known as producers of the antibiotics spectinomycin and netropsin. The pheno- and genotypical properties of some of the strains were determined and compared. No significant difference was detected between Streptomyces flavopersicus NRRL B-2820, Streptoverticillium baldaccii ATCC19756 and Streptomyces netropsis DSM40093. Therefore most investigations were carried out with S. flavopersicus NRRL B-2820. Different media compositions and culture conditions for the production of the aminoglycoside antibiotic spectinomycin were tested until the antibiotic could be concentrated from a culture broth of S. flavopersicus NRRL B-2820 in sufficient amounts and purified after modification of published methods. The production of spectinomycin was proven by bio-assays, thin-layer chromatography and HPLC analysis. The synthesis of a second antibiotic, that has not been found in S. flavopersicus before, interfered with the detection of spectinomycin. Due to the properties of the active agent and the close relationship of S. flavopersicus NRRL B-2820 and S. netropsis DSM40259, a producer of the peptide antibiotic netropsin, it was assumed that this substance is identical to netropsin. The biosynthesis gene cluster for spectinomycin was cloned using a cosmid gene library from S. flavopersicus NRRL B-2820. One cosmid containing the assumedly whole biosynthesis cluster was identified, sequenced and analysed. In this region 21 complete and 2 incomplete ORFs were identified. The functions of the putative proteins were deduced from database comparisons and the proteins were classified into protein families. Putative functions in spectinomycin biosynthesis could be assigned for 16 proteins (SpcRNTABCDXEYFGHIJK). In particular, there was a transcriptional regulatory protein, a spectinomycin resistance protein, a transport protein, a monophosphatase, two dehydrogenases, two aminotransferases/ dehydratases, an epimerase, a keto-isomerase, a 4,6-dehydratase, a glycosyltransferase, a methyltransferase, a thymidylyltransferase, a sugar binding protein and a protein which showed similarity to molybdenum-cofactor-biosynthesis proteins. The cluster was compared to the spectinomycin biosynthesis genes from S. spectabilis NRRL2494 and S. spectabilis NRRL2792. A putative pathway for the biosynthesis of spectinomycin was postulated in consideration of all available data. The spectinomycin phosphotransferase SpcN was identified as spectinomycin resistance enzyme in S. flavopersicus NRRL B-2820 and in S. spectabilis NRRL2494. The spcN gene of S. spectabilis NRRL2494 was expressed in Escherichia coli and the protein was purified by immobilised metal affinity chromatography. Different assays were carried out with the purified protein. It was demonstrated that SpcN phosphorylates spectinomycin and dihydro-spectinomycin, an intermediate of the biosynthesis pathway, in an ATP-dependent reaction. The enzyme exhibited a stringent substrate specifity, i.e., it showed no activity against other tested aminoglycoside antibiotics and there was no competitive inhibition by other antibiotics. The KM-value of the spectinomycin phosphotransferase for spectinomycin was approximately 20 µM. There are two putative oxidoreductase-encoding genes in the spectinomycin gene cluster, spcB and spcH, but in the postulated biosynthesis pathway more dehydrogenase reactions are needed. An exact assignment of the enzymes to the catalysed reactions was not possible. The proteins SpcB and SpcH were expressed in E. coli. In assays using four of the possible substrates (myo-inositol, scyllo-inosose, spectinomycin and dihydrospectinomycin) and the coenzymes NAD(P)+ and NAD(P)H no activity of either SpcB or SpcH was found. Inactivation of several biosynthesis genes using different methods showed no success. The reasons were the very low transformation efficiency of S. flavopersicus and that no spores with single chromosomes were obtained. Experiments regarding the combinatorial biosynthesis, i.e., the replacement of the methyltransferase gene spcG in S. flavopersicus through the amidinotransferase gene strB1 from S. griseus N2-3-11, could therefore not be realised. However the reciprocal replacement of the gene strB1 in S. griseus by spcG resulted in mutants that did not show antibiotic activity. The search for the netropsin resistance determinant from S. flavopersicus NRRL B-2820 revealed two genes netP1 and netP2. The deduced proteins displayed homology to ABC-transporters and shared some characteristic motifs, i.e., the transmembrane and ATP-binding domains with these proteins. When one of the two genes was mutated, the mutants still exhibited weak netropsin resistance in different assays. It is speculated, that the transport proteins NetP1 and NetP2 usually act as heterodimers, but can possibly also form homodimers. The detected genome fragment will serve as a probe to identify the netropsin biosynthesis gene cluster in a genomic library.