Regulatoren des Zellteilungszyklus der Hefe Saccharomyces cerevisiae: die Polo-Kinase Cdc5 und der Ubiquitinierungsfaktor Hct1

Abstract

Ein Teil der vorliegenden Arbeit befasst sich mit der Regulation der Cdc5-Aktivität durch zyklinabhängige Kinasen. Cdc5 besitzt fünf Konsensusstellen für Phosphorylierung durch CDKs. Durch ortsspezifische Mutagenese und in vitro Kinaseassays konnte gezeigt werden, dass Cdc5 tatsächlich ein Substrat für Komplexe aus Cdc28 mit B-Typ Zyklinen ist. Es ergaben sich weiterhin Hinweise darauf, dass die Phosphorylierung von Cdc5 durch CDK positiv auf die Cdc5-Kinaseaktivität wirkt. Zudem zeigt Cdc5 eine intermolekulare Autophosphorylierung. Der Austausch der dritten Cdc28-Konsensusstelle zu einer nicht-phosphorylierbaren Aminosäure hat einen kompletten Funktionsverlust des resultierenden Proteins zur Folge. Es ist allerdings nicht geklärt, ob diese Stelle in vivo tatsächlich phosphoryliert wird, oder ob sie beispielsweise aus strukturellen Gründen wichtig ist für die Enzymaktivität von Cdc5. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Regulation des APC-Spezifitätsfaktors Hct1. Hct1 vermittelt am Ende der Mitose die ubiquitinabhängige Degradation von Clb2, indem es dieses bindet und an den APC rekrutiert. Der APC ist eine multimere Ubiquitinligase und vermittelt die Polyubiquitinierung seiner Substrate. Die Bindung von Hct1 an den APC wird von zyklinabhängiger Kinase negativ reguliert. Hct1 besitzt elf Konsensusstellen für eine Phosphorylierung durch Zyklin-Cdc28-Komplexe. Ein Derivat, in dem alle elf Stellen nicht mehr phosphorylierbar sind, ist hyperaktiv. Es sollte nun im Detail geklärt werden, welchen Beitrag die einzelnen Konsensusstellen zur Inaktivierung von Hct1 leisten. Untersucht wurde die Lebensfähigkeit der Zellen nach Überproduktion verschiedener Hct1-Derivate und deren Fähigkeit zur Degradation von Clb2. Zudem wurde das Laufverhalten der verschiedenen Proteine im Western Blot untersucht. Es ergab sich, dass keine der untersuchten Stellen alleine eine vollständige Inaktivierung von Hct1 bewirken kann. Es konnten allerdings Positionen identifiziert werden, die einen stärkeren Einfluss auf die Hct1-Aktivität haben als andere. Besonders die vier Konsensusstellen im N-Terminus von Hct1 scheinen effizient phosphoryliert zu werden. Aber auch Stellen, die für sich alleine keinen Effekt auf die Hct1-Aktivität haben, bewirken in Kombination mit anderen Positionen eine Inhibierung von Hct1. Hct1 ist aber nicht nur ein Substrat für CDK, sondern auch für Cdc5-Kinase. Die Überproduktion von Cdc5 bewirkt eine Hyperphosphorylierung von Hct1, die von den ersten vier Cdc28-Konsensusstellen in Hct1 abhängig ist. Zudem interagiert Cdc5 präferentiell mit phosphorylierten Formen von Hct1. In in vitro Kinaseassays ist unphosphoryliertes Hct1 ein sehr schlechtes Substrat für Cdc5. Liegt Hct1 allerdings nach Behandlung mit zyklinabhängiger Kinase in phosphorylierter Form vor, wird es ein deutlich besseres Substrat für Cdc5. Diese Ergebnisse belegen, dass beide Gruppen mitotischer Kinasen, zyklinabhägige Kinasen und Polo-Kinasen, bei der Regulation von Hct1 kooperieren. Weiterhin konnten in dieser Arbeit neue Interaktionspartner von Cdc5 identifiziert werden. So interagiert Cdc5 mit dem Anaphaseinhibitor Pds1. Pds1 wird am Metaphase/Anaphase-Übergang APC-abhängig degradiert. Dieser Prozess ist abhängig von Cdc20, neben Hct1 ein weiterer mitotischer Spezifitätsfaktor des APC. Es konnte nun gezeigt werden, dass erhöhte Mengen an Cdc5 die APCCdc20-abhängige Pds1-Degradation in Metaphase-arretierten Zellen induzieren. Eine kinase-inaktive Mutante von Cdc5 zeigt diesen Effekt nicht mehr. Gleichzeitig scheint Pds1 aber auch ein Aktivator von Cdc5 zu sein, da die Deletion von PDS1 die Wirkung der Überexpression von CDC5 auf Clb2 und Sic1 negativ beeinflusst. Cdc5 interagiert außerdem mit Lte1. Lte1 ist der GEF (guanine nucleotide exchange factor) des G-Proteins Tem1 und aktiviert dieses durch den Austausch von gebundenem GDP zu GTP. Auf diese Weise stimuliert Lte1 den Austritt aus der Mitose. Lte1 zeigt eine zellzyklusabhängige Phosporylierung und obgleich vornehmlich phosphorylierte Formen von Lte1 mit Cdc5 interagieren, ist Cdc5 nicht direkt für die Phosphorylierung von Lte1 verantwortlich. Ein weiterer bisher unbekannter Interaktionspartner von Cdc5 ist Rad9. Rad9 ist Teil eines Kontrollsystems, das bei einer Beschädigung der genomischen DNA zu einem Zellzyklusarrest vor dem Beginn der Anaphase führt. Dadurch bleibt der Zelle Zeit, den Schaden zu reparieren bevor sie sich erneut teilt. Ein derartiger Kontrollmechanismus gewährleistet die Integrität des genetischen Materials, das an die Nachkommen weitergegeben wird. Erhöhte Mengen an Cdc5 beeinflussen die Modifikation von Rad9. Außerdem bewirken sie, dass Zellen, die aufgrund eines DNA-Schadens in der Metaphase arretiert sind, teilweise ihre Kerne teilen und die Spindel auflösen. Dies ist begleitet von einer Degradation von Pds1.

This work deals with two mitotic regulators in budding yeast: the kinase Cdc5 and the APC-specificity factor Hct1. Cdc5 function is essential for the cells to survive. Mutants arrest their cell cycle at the end of mitosis with duplicated DNA, an elongated spindle and elevated levels of Clb2 suggesting a mitotic exit defect. Cdc5 is part of a signal transduction network that inactivates cyclin-dependent kinases at the end of mitosis. Elevated levels of Cdc5 induce the degradation of the B-type cyclin Clb2 and the accumulation of the CDK (cyclin-dependent kinase) inhibitor Sic1. Therefore it’s most important that Cdc5 itself is regulated in a strict manner. This work tried to get insights into the regulation of Cdc5 activity by cyclin-dependent kinases. Cdc5 has five consensus sites for phosphorylation by cyclin-dependent kinases. Site-specific mutagenesis and in vitro kinase assays revealed that Cdc5 is in fact a substrate for Cdc28-cyclinB complexes. The data indicate that Cdc5 activity is positively regulated by phosphorylation by CDK. Besides, Cdc5 autophosphorylates itself in an intermolecular fashion. Mutation of the threonine in the third Cdc28-consensus site in Cdc5 results in a loss-of function phenotype of the protein. It’s not yet clear if this site is phosphorylated in vivo or if the threonine is important for the overall structure of the protein. A second part of the work is dealing with the regulation of Hct1, a substrate recognition factor of the APC. Hct1 mediates the ubiquitin-dependent degradation of Clb2 at the end of mitosis. Hct1 binds to Clb2 and recruits it to the ubiquitin ligase APC. Binding of Hct1 to the APC is negatively regulated by cyclin-dependent kinases. There are eleven sites for phosphorylation by CDK in Hct1. A derivative of Hct1 lacking all these sites is hyperactive. So, the impact of single sites on the inactivation of Hct1 was analysed in detail. Induction of Clb2-degradation and survival of the cells after overexpression of various constructs were investigated. The mobility of the different proteins was analysed in western blot experiments. None of the single sites were able to inactivate Hct1 completely. But clearly some sites have a stronger influence on Hct1 inactivation than others. Especially the four Cdc28-consensus-sites in the N-terminal part of Hct1 seemed to be efficiently phosphorylated. Sites, which do not have any influence on Hct1 activity on their own, contribute to the inactivation of Hct1 in combination with other sites. Additionally, Hct1 is a substrate for Cdc5. Overproduction of Cdc5 causes a hyperphosphorylation of Hct1 that is dependent on the first four Cdc28-consensus sites. Cdc5 interacts preferentially with phosphorylated species of Hct1. Hct1 is a very poor substrate for Cdc5 in vitro, but phosphorylation is strongly enhanced when Hct1 was phosphorylated by CDK. So cyclin-dependent kinases and polo-kinase clearly cooperate in the regulation of Hct1. In this work new interaction partners of Cdc5 were identified. Cdc5 interacts with the anaphase inhibitor Pds1. Pds1 is degraded at the metaphase to anaphase transition in an APCCdc20-dependent manner. Like Hct1 Cdc20 is a mitotic substrate recognition factor of the APC. It was shown that elevated levels of Cdc5 induce the APCCdc20-dependent degradation of Pds1 in metaphase-arrested cells. For this, kinase activity of Cdc5 is necessary. At the same time Pds1 seems to by an activator of Cdc5 because deletion of PDS1 influences the ability of Cdc5 to phosphorylate Clb2 and to up regulate the levels of Sic1. Besides, Cdc5 interacts with Lte1. Lte1 is the GEF (guanine nucleotide exchange factor) of the G-protein Tem1. It converts GDP-bound Tem1 to GTP-Tem1 thereby activating Tem1 and stimulating the exit of mitosis. Lte1 is phosphorylated in a cell cycle-dependent manner. Though Cdc5 interacts with phosphorylated Lte1 it seems not to be responsible for the phosphorylation of Lte1. Another so far unknown interaction partner of Cdc5 is Rad9. Rad9 is part of a surveillance mechanism that delays the cell cycle in metaphase in response to DNA damage giving the cell time to repair the damage. This ensures the integrity of the genomic material propagated to the daughter cell. Elevated levels of Cdc5 influence the modification of Rad9. Furthermore, elevated Cdc5 activity promotes nuclear division and disassembly of the spindle in cells arrested due to DNA-damage. This is accompanied by degradation of Pds1.