Rekombinante Hepatitis B Virus Kapside : Untersuchungen zur Eignung als ikosahedrale Träger für Strukturuntersuchungen, zur in vitro Assemblierung und Nukleinsäureverpackung

Abstract

Das aus 183 aa bestehende Hepatitis B Virus (HBV) Coreprotein bildet ikosahedral symmetrische Kapside aus 180 bzw. 240 identischen Untereinheiten. Rekombinantes Coreprotein (HBc) kann ohne die Beteiligung anderer Proteine zu Kapsid-ähnlichen Partikeln (CLPs) assemblieren, wobei die Bildung von CLPs auch dann erhalten bleibt, wenn Fremdproteine, wie an Hand des Green Fluorescent Protein (GFP) als Modell gezeigt, geeignet an HBc fusioniert werden. HBc-abgeleitete CLPs können somit als ikosahedrale Trägerstruktur für Fremdproteine betrachtet werden. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde untersucht, in wieweit CLPs mit zentral in die HBc-Sequenz inserierten Fremd-Domänen für eine hochauflösende Strukturanalyse der Fremd-Domänen durch Kryo-Elektronenmikroskopie und Bildverarbeitung nutzbar gemacht werden können, so wie dies zuvor für das unmodifizierte HBV Coreprotein gelungen war. Frühere Versuche hatten gezeigt, dass die GFP-Domänen auf der CLP-Oberfläche präsentiert werden. Die Wahl absichtlich langer Linkersequenzen an den GFP-Termini hatte aber anscheinend zu einer so flexiblen Verbindung geführt, dass es nicht zur regelmäßigen Anordnung der GFP-Domänen kam, wie sie für die gewünschte Anwendung erforderlich ist. Neben der Steigerung der Ausbeute an reinen Partikelformen war die Optimierung des Linkers daher essentiell für die verbesserte Auflösung der Struktur. Mit zunehmender Verkürzung des Linkers konnte die Flexibilität der Befestigung so weit reduziert werden konnte, dass die Fremd-GFP-Domänen in eine nahezu ikosahedrale Anordnung gezwungen wurden. Durch die erhöhte Auflösung konnte die bekannte Struktur von GFP erstmals sinnvoll in die erhaltenen Elektronendichtekarten „gefittet“ werden. Eine Limitierung der Anwendung lag in der unerwarteten Flexibilität der Core-Schale selbst, da es mit steigender Auflösung der GFP-Struktur zu einer zunehmenden Umordnung der Coreoberfläche kam. Die Verwendung von weiteren Fremd-Proteinen mit einer zu GFP verwandten Struktur lieferte wichtige Erkenntnisse zur generellen Übertragbarkeit der Methode auf Proteine unbekannter Struktur. HBV CLPs mit inserierten Fremd-Domänen sind auch als immunverstärkende Impfstoff-Träger von Interesse, insbesondere wenn sie ein vollständiges, nativ gefaltetes Fremdantigen präsentieren. Neben der korrekten 3D-Faltung des Fusionsproteins stellt das begrenzte Raumangebot auf der Oberfläche bzw. im Inneren der CLPs ein Problem dar. Lösung besteht darin, einen Teil der Fusionsproteine in den CLPs durch sterisch weniger anspruchsvolle HBc-Untereinheiten zu ersetzen („Mosaik-Partikel“). Im zweiten Teil wurde daher eine Methode zur in vitro Assemblierung von separat exprimierten HBc-Varianten entwickelt. Sie beruht auf der selektiven Bindung der Coreproteine über fusionierten Histidinreste an eine Ni2+-Affinitätssäule unter semi-denaturierenden Bedingungen und einer gemeinsamen Reassoziation der HBc-Untereinheiten unter nativen Bedingungen. Die Anwendbarkeit wurde zunächst am Beispiel einer assemblierungsfähigen Corefusionsprotein Variante gezeigt. Darüber hinaus ließ sich eine an sich nicht-assemblierungsfähige Corefusionsprotein Variante, deren C-terminal fusionierte GFP-Domäne das Raumangebot des CLP-Innenraums überschreiten würde, ebenfalls in partikulärer Form erhalten. Die vorgestellte Methode scheint ausbaufähig für medizinische relevante Antigene, wobei die Anwendung auch für mehr als nur einen Antigentyp pro CLP denkbar ist. Die eigentliche Funktion des Kapsids im Lebenszyklus von HBV ist die eines schützenden Transportbehälters für das virale Genom. Im dritten Teil wurde untersucht, ob sich das neue in vitro Assemblierungsverfahren zur gezielten Verpackung heterologer Nukleinsäuren in CLPs nutzen lässt. Dies wäre eine Voraussetzung u.a. zur Anwendung von CLPs als Gentransfer-Vehikel. Durch Einbeziehung von Teilabschnitten der C-terminalen Nukleinsäurebindungsdomäne wurden reversibel dissoziierbare HBc-Varianten hergestellt, mit denen im Rahmen von bestimmten Verpackungskapazitäten, Nukleinsäuren in CLPs verpackt werden konnten. Die Phosphorylierung der Nukleinsäurebindungsdomäne spielt eine wichtige, aber mechanistisch nicht verstandene Rolle bei der Nukleinsäureverpackung sowie beim intrazellulären Transport des Nukleokapsids. Die Identität der verantwortlichen Kinase ist umstritten, wobei die Serin-Arginin-Protein-spezifische-Kinase 1 (SRPK 1) als aussichtsreicher Kandidat gilt. Im vierten Teil wurde SRPK 1 rekombinant hergestellt und eine Methode zur in vitro Phosphorylierung von Coreproteinen entwickelt. Durch Koexpression von Coreproteinen und SRPK 1 in E. coli konnten erstmals definiert phosphorylierte CLPs in präparativen Mengen hergestellt und die strukturellen und funktionellen Auswirkungen dieser Modifikation, wie z.B. der Transport zur Kernpore genauer untersucht werden.

The 183 aa hepatitis B virus (HBV) core protein forms icosahedral capsids of two different sizes, containing either 180 or 240 identical subunits, respectively. When expressed recombinantly, HBc assembles spontaneously into capsid-like particles (CLPs). This ability is still maintained when the green fluorescent protein (GFP), as a model insert, was appropriately fused into the centre of the core protein sequence. Furthermore, the GFP moieties were shown to be presented at the surface of the core particles. HBc-derived CLPs may therefore be considered as icosahedral platforms for foreign proteins. In this work it was analyzed whether CLPs with such central GFP insertions are suitable for structural analyses with high resolution by using electron cryo-microscopy and computer-based image processing, as previously demonstrated for the unmodified core protein. Previous studies had shown that the deliberately long linkers in the original fusion protein led to a rather flexible connection between carrier and GFP moieties that resulted in a non regular distribution of the GFP domains on the CLP surface and in three-dimensional maps of low resolution. Besides the improvement of expression and purification protocols, leading to enhanced yields of pure particles, optimization of the linker sequence was essential to obtain a higher resolution for the foreign protein domains. Shortening of the linker sequence led to a more rigid fixation of the GFP domains, forcing them into a well ordered, almost icosahedral symmetry. This finally led to a sufficient high resolution to fit the known structure of GFP into the electron density maps. However, a restriction was the unexpected flexibility of the core shell structure itself. While linker shortening allowed for a higher resolution of the GFP structure, it also led to a fundamental distortion of the core dimers within the shell. Central insertion of other proteins, with structural relation to GFP, showed that the foreign epitope itself has a major influence on the core carrier. HBc-derived CLPs displaying foreign domains are also of high interest as potential immune-enhancing vaccine carriers, especially when presenting complete and natively folded antigens. Besides the proper 3-D folding of the fusion protein, the limited space on the surface or inside the CLPs can give rise to problems. A possible solution is the partial replacement of fusion protein subunits by unmodified HBc, reducing the overall sterical hindrances. Using separately expressed wild type and fusion proteins, an in vitro assembly system could be developed in the second part of this work. The method is based on the selective binding of the two proteins to immobilized nickel ions, mediated by histidine residues, under partly denaturing conditions and the simultaneous re-association under native conditions. The feasibility of this method was first verified by using a fully assembly-competent core fusion protein. Next, an assembly incompetent variant whose C-terminally fused GFP domains would exceed the space provided in the lumen of the CLPs, was successfully converted into regularly shaped mosaic particles. With the option to use more the one type of antigen on one CLP, the in vitro assembly system may become useful for vaccination applications. In the life cycle of HBV the main function of the capsid is that of a protective transport container for the viral genome. The third part of this work analyzed whether the newly developed in vitro assembly system could be used to specifically package heterologous nucleic acids into HBc-derived CLPs. By including parts of the authentic C-terminal nucleic acid binding domain, core variants could be constructed which allow for reversible dissociation and packaging of DNA fragments into the assembled CLPs within a determined packaging capacity. Phosphorylation sites within the nucleic acid binding domain of the core protein appear to play an important, yet mechanistically unclear function in packaging of nucleic acids, as well as in intracellular transport of the nucleocapsids. The identity of the responsible kinase is discussed controversially, but the Serine-Arginine protein-specific Kinase 1 (SRPK 1) seems to be a good candidate. In the last part, SRPK 1 was expressed in E. coli and used for in vitro phosphorylation of recombinant HBV and DHBV core particles. By co-expression of SRPK 1 and core protein, for the first time, preparative amounts of core protein with a defined phosphorylation status could recombinantly be produced, providing a good source to analyze the structural and functional consequences of this post translational modification. So far it was shown that SRPK 1 phosphorylation substantially reduced the amount of encapsidated bacterial RNA in recombinant HBc-CLPs. Secondly, phosphorylation by SRPK 1 led to exposure of the nuclear localization signal embodied in the core protein and to transport of recombinant CLPs towards the nuclear pore.