Poly(cis-1,4-Isopren) Oxygenase A (RoxA) : Identifizierung, Isolierung, Charakterisierung, Kristallisation und Reaktionsmechanismus einer neuartigen extrazellulären Dioxygenase

Abstract

Naturkautschuk, oder Poly(cis-1,4-Isopren) ist unter quantitativen und qualitativen Gesichtspunkten eines der bedeutendsten Biopolymere unserer Zeit. Polyisopren häuft sich nicht in der Umwelt an und muss deshalb einem biologischen Abbauprozess unterliegen. Obwohl Produkte aus Naturkautschuk seit ca. 100 Jahren im Millionen-Tonnen Maßstab von Menschen verwendet werden, sind die dem biologischen Abbau zugrunde liegenden biochemischen Mechanismen unbekannt. Aus diesem Grund war es das Ziel dieser Arbeit, die Biochemie der enzymatischen Polyisoprenspaltung mit Xanthomonas sp. 35Y als Modellorganismus zu untersuchen.

Aus 20 Litern Kulturüberstand einer auf Latexmilch gewachsenen Xanthomonas sp. 35Y Kultur wurde ein extrazelluläres Protein zur Homogenität gereinigt, das in vitro zur Spaltung von Polyisopren in der Lage war. Dieses Protein wurde als "rubber oxygenase A" (RoxA) bezeichnet. Das Hauptabbauprodukt der RoxA katalysierten Spaltungs-reaktion wurde isoliert und seine Struktur als 12-Oxo-dimethyltrideca-4,8-diene-1-al (ODTD) durch 1H-NMR und HPLC-MS Messungen bestimmt. Neben ODTD wurden verwandte Metabolite, die sich nur in der Anzahl der Isopreneinheiten zwischen den terminalen Endgruppen (CHO-CH2- und -CH2-COCH3) unterscheiden, ebenfalls nachgewiesen. Die Reaktion des Enzyms mit Polyisopren war strikt von Sauerstoff abhängig, benötigte keine Kofaktoren oder Metallionen und zeigte einen optimalen Umsatz bei pH 7,0 und 40 °C. Isoliertes RoxA weist eine tiefrote Farbe mit für Hämproteine charakteristischen Absorptionsmaxima bei 406 nm, 532 nm, 560 nm und 672 nm im oxidierten und 418 nm, 522 nm, 549 nm und 554 nm im reduzierten Zustand auf. Das Vorhandensein von zwei Häm-Zentren mit jeweils einem Eisenatom wurde über unabhängige Verfahren nachgewiesen und stimmt mit zwei aus der Aminosäuresequenz von RoxA postulierten Häm-Bindemotiven für kovalente Häm-Bindung überein. Durch 18O2-Markierungsexperimente, für die eine enzymatische Derivatisierung von ODTD zur Stabilisierung der Isotopenmarkierung entwickelt wurde, wurde gezeigt, dass RoxA Polyisopren durch einen Dioxygenasemechanismus spaltet. Durch Elektronen-Paramagnet-Resonanz-Spektroskopie (EPR) und eine spektroskopische Redoxtitration konnte gezeigt werden, dass RoxA zwei unterschiedliche Häm-Gruppen mit Redoxpotentialen von -65 mV und –145 mV (beide vs Normalwasserstoffelektrode (NHE)) mit je einem Fe(III) im Zentrum besitzt. Ein Zentrum lag ausschließlich im Fe(III) low spin Zustand vor und wurde von zwei Histidinresten koordiniert. Das andere Zentrum lag zum einen Teil ebenfalls im Fe(III) low spin Zustand, von zwei Histidinresten koordiniert, zum anderen Teil aber im Fe(III) high spin Zustand, von nur einem Histidinrest koordiniert vor, so dass eine Koordinationsstelle frei bleibt. EPR-Messungen nach unterschiedlich langer anaerober Inkubation von RoxA mit Substrat wiesen auf eine von der Inkubationszeit abhängige Bildung eines organischen Radikals hin. Durch diese experimentellen Befunde wurde erstmals ein neuer, nicht nur auf theoretischen Überlegungen basierender Reaktionsmechanismus für die Spaltung von Poly(cis-1,4-Isopren) formuliert. Es wurde ein Kristallisationsprotokoll für RoxA entwickelt und RoxA Proteinkristalle erhalten. Diese Kristalle wurden mittels Röntgenstrukturanalyse untersucht, wobei die Kristalle bis zu einer Auflösung von 2 Å streuten. Derzeit erfolgt die Strukturauflösung von RoxA in Kooperation mit einem Kristallographen.

Natural rubber, or poly(cis-1,4-isoprene) is under qualitative and quantitative aspects one of the most important biopolymers of our time. Polyisoprene does not accumulate in the environment which indicates that it must be biodegradable. For almost 100 years millions of tons of natural rubber derived products have been produced by mankind per year. However, the biochemical mechanisms of biological rubber degradation are still unknown. The aim of this work was to investigate the biochemical principles of the enzymatic cleavage of polyisoprene with Xanthomonas sp. 35Y serving as a model organism.

A protein was purified to homogeneity from 20 liter supernatant of a rubber grown Xanthomonas sp. 35Y culture that was capable of cleaving polyisoprene in vitro. Therefore this protein was named “rubber oxygenase A” (RoxA). The major degradation product of RoxA induced polyisoprene cleavage was isolated and the structure was determined as 12 oxo-dimethyltrideca-4,8-diene-1-al (ODTD) by 1H-NMR and HPLC-MS analysis. Beside ODTD there was a homologous series of minor metabolites that differed from ODTD only in the number of repetitive isoprene units between the terminal functions (CHO-CH2- and CH2 COCH3). Enzymatic cleavage of rubber by RoxA was strictly dependent on the presence of oxygen, required no cofactors or metal ions and was optimal around pH 7.0 and 40 °C. Purified RoxA shows a red colour and strong absorptions bands characteristic for heme-containing proteins at 406 nm, 532 nm, 560 nm and 672 nm in the oxidized and at 418 nm, 522 nm, 549 nm and 554 nm in the reduced state. The existence of two heme-iron-centers was confirmed by different, independent methods, being in agreement with the roxA derived aminoacid-sequence, showing two potential heme-binding sites for covalent heme attachment. 18O2-labelling experiments, includeing the development of a method for stabilization of the isotope label by enzymatic derivatisation, confirmed that RoxA cleaves rubber by a dioxygenase mechanism. Electron-paramagnetic-resonance-spectroscopy (EPR) and optical redoxtitration experiments showed that RoxA features two different Fe(III)-heme-centers with redoxpotentials of about -65 mV and 145 mV (both vs normal hydrogen electrode (NHE)). One Fe(III)-heme-center exclusively existed in the low spin state coordinated by two histidine residues. The other Fe(III)-heme-center existed mainly in the low spin state coordinated by two histidine residues, with detectable traces of an Fe(III) high spin state coordinated by only one histidine residue, resulting in one free coordination site. EPR-measurements of RoxA after prolonged anaerobic incubation with substrate showed the formation of an organic radical over time. A new, unique reaction mechanism for poly(cis-1,4-isoprene) cleavage, based on experimental results was postulated. A crystallization protocol for RoxA was developed and RoxA protein crystals were obtained. Defraction analysis of RoxA crystals showed a resolution of 2 Å. The structure of RoxA is presently solved in cooperation with a crystallographer.