Die Bedeutung der H-Untereinheit des Reaktionszentrums bei der Assemblierung des Lichtsammelkomplexes LH1 in Rhodospirillum rubrum

Abstract

Das photosynthetische Bakterium Rhodospirillum rubrum gehört zur Familie der Nichtschwefelpurpurbakterien (Rhodospirillaceae). Es zeichnet sich durch seinen vielfältigen Stoffwechsel aus, darunter die Fähigkeit fakultativ photosynthetisch zu wachsen. Dabei vollzieht es eine sogenannte anaerobe, anoxygene Photosynthese; dazu dient der photosynthetische Apparat (PSA). Dieser PSA befindet sich in spezialisierten Membranen, die aus der inneren Membran des Bakteriums durch Einstülpung hervorgehen und intracytoplasmatische Membranen (ICM) genannt werden. Die Produktion der ICM unterliegt der Regulation durch ein Netzwerk verschiedener Komponenten, die hauptsächlich auf den Sauerstoffpartialdruck ansprechen. Sobald dieser unter den Schwellenwert von 1% sinkt werden sogar im Dunkeln ICM produziert. Die Hauptkomponente des PSA ist die photosyn-thetische Einheit (PSU). Sie besteht aus einem Lichtsammelkomplex LH1 und dem photo-synthetischen Reaktionszentrum RC. Der LH1 aus R. rubrum besteht aus 16 Heterodimeren, wobei jedes Heterodimere aus zwei kleinen Polypeptiden a und b aufgebaut ist, an die zwei Bakteriochlorophyllmoleküle und ein Carotinoid gebunden sind. Die LH1 bilden, wie Strukturanalysen aus R. rubrum bei mittlerer Auflösung ergaben, eine geschlossene Struktur um das RC aus. Vom RC aus R. rubrum gibt es keine Strukturdaten, aber es sind Strukturen aus verwandten Arten vorhanden, die durch Röntgenbeugungsanalysen an RC-Kristallen erhalten worden waren. Diese RC-Strukturen zeigen alle den gleichen Aufbau: Sie bestehen, wie schon früher biochemisch festgestellt, aus drei Untereinheiten (H, M und L). Die Konfor-mation der Heterotrimeren ist identisch und bestätigt frühere Untersuchungen, dass nur die M- und die L-Untereinheit die photosynthetisch relevanten Cofaktoren binden: Vier Bakterio-chlorophyllmoleküle, zwei Bakteriophaeophytine, ein Carotinoid, zwei Ubichinonmoleküle und ein Eisenatom. Die Funktion der H-Untereinheit dagegen wurde später durch biochemische, molekularbiologische und strukturbiologische Methoden näher charakterisiert. Die Ergebnisse zeigten für die H-Untereinheit eine wichtige Rolle beim Zusammenbau des RC bzw. der PSU, sowie eine Beteiligung am Primärprozess der Photosynthese: Das Fehlen der H-Untereinheit äußerte sich in der Abwesenheit funktioneller RCs, der Unfähigkeit zur Photosynthese und drastisch verminderten LH1- und ICM-Mengen. Dabei waren aber in einigen Studien, darunter die an R. rubrum, nicht nur das Gen für die H-Untereinheit (puhA) deletiert, sondern auch flankierende Gensequenzen entfernt worden. In neueren Arbeiten wurde der mehrteilige Aufbau der H-Untereinheit untersucht und den einzelnen Domänen Funktionen zugeordnet. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Projekte mit folgenden Zielsetzungen bearbeitet: – Die genauere Charakterisierung von H-Untereinheitsmutanten aus R. rubrum, die durch einen präzisen genetischen Eingriff hergestellt wurden, und deren Rückführung in den ursprünglichen Elternstatus, mit dem Ziel ein Deletions/Komplementations-system zu etablieren. – Darauf aufbauend sollten durch zielgerichteter Mutagenese an der H-Untereinheit Domänen definiert und deren Funktion untersucht werden. Das Ziel war die minimale Komponente der H-Untereinheit zu definieren, die in den oben genannten Mutanten den Elternstatus wiederherstellte. – Das Protokoll zur Isolierung und Aufreinigung der PSU aus R. rubrum sollte modifiziert und optimiert werden. Angestrebt war eine einfachere und kostengünstige-re Methode, um große Mengen an reiner PSU zu erhalten. – Die aufgereinigte PSU aus R. rubrum sollte biophysikalisch, biochemisch und strukturbiologisch untersucht werden, um die Geometrie des LH1 in der PSU zu klären, die Komponenten der isolierten PSU zu identifizieren und die PSU zu kristallisieren. Die genaue Charakterisierung der Mutanten der H-Untereinheit zeigte, dass die durch die Abwesenheit der H-Untereinheit verursachte Reduktion der LH1- und ICM-Mengen aufgehoben werden konnte. Erreicht wurde dies durch die Kultivierung der H-defizienten Stämme in Medien verschiedener Zusammensetzung. Das Deletions/Komplementations-system konnte etabliert werden, indem der ursprüngliche Elternstatus durch ein Plasmid wiederhergestellt wurde, welches das Gen für die H-Untereinheit besaß. Von diesem Plasmid ausgehend, konnte durch ein molekularbiologisches Design die H-Untereinheit erfolgreich in zwei Domänen getrennt werden. Zum ersten Mal wurde gezeigt, dass die getrennten, aber gemeinsam exprimierten Domänen die Funktion eines intakten H-Proteins beibehalten und somit in der Lage waren, den ursprünglichen Elternstatus in H-defizienten Stämmen hervorzurufen. Durch den einzigartigen Befund, dass jede Domäne für sich, selbständig exprimiert, in der Lage war, RC-Komplexe zu bilden und photosynthetisches Wachstum zu ermöglichen, konnten gleich zwei verschiedene minimale Komponenten definiert werden. Die genetischen Konstrukte, sowie die erhaltenen Expressionsstämme stellen die Grundlage für zukünftige Projekte dar. In diesen soll eine Beteiligung der H-Untereinheit am Regulationsnetzwerk untersucht bzw. dessen Einfluss auf die Sauerstoffempfindlichkeit der generierten Stämme systembiologisch geklärt werden. Das alte Protokoll zur Isolierung und Aufreinigung der PSU aus R. rubrum konnte in seinem Ablauf deutlich vereinfacht werden. Durch die Wahl eines geeigneten Detergenz bzw. des Säulenmaterials für die Chromatographie wurde eine wesentliche Kosteneinsparung erreicht. Mit dem neuentwickelten Protokoll können bei gleicher Ansatzgröße, im Vergleich zum alten, zehnfach höhere Mengen an PSU isoliert werden. Das Absorptionsspektrum dieser PSU-Präparation entsprach dem unbehandelter ICM und die biochemische Analyse mittels Gelelektrophorese zeigte das gleiche Profil wie PSU-Präparationen nach dem alten Protokoll. Die in den PSU enthaltenen Proteine wurden durch Aminosäuresequenzierung mit Hilfe der Massenspektrometrie identifiziert. Dabei handelt es sich um die erste Studie, in der Komponenten der isolierten PSU mit dieser Methode charakterisiert werden. Zusätzlich zu den Komponenten des RC und LH1 wurde ein Protein der äußeren Membran, Porin 41, in der PSU-Präparation gefunden, welches in intensiver Wechselwirkung mit der PSU steht. In zukünftigen Projekten soll geklärt werden, ob dieses Porin ein echter Bestandteil der PSU ist oder aber ein Reinigungsartefakt; wobei im ersten Fall natürlich die Frage nach der Funktion des Porins zu beantworten sein wird. Zur Klärung der Geometrie des LH1 in der PSU wurden Einzelmolekülspektroskopiemessungen durchgeführt und ergaben einen eindeutig zirkular-symmetrischen Aufbau des LH1 um das RC. Dieser Befund galt für detergenz-solubilisierte PSU, aber auch für PSU, die erstmals in Lipidvesikeln rekonstituiert worden waren. Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu jenen anderer Arbeitsgruppen, die alle elliptisch deformierte LH1-Komplexe in ihren PSU-Präparationen fanden. Die zweidimensionale Kristallisation zur Aufklärung der PSU-Struktur wurde soweit optimiert, dass Kristalle in reproduzierbarer Qualität erhalten wurden. Deren Auflösung lag im mittleren Bereich und ist weiter zu verbessern. Auch die dreidimensionale Kristallisation der PSU kann nunmehr in Angriff genommen werden, da die benötigte Proteinmenge mit dem neuen Protokoll erreicht wird. Mit dem neuentwickelten Reinigungsverfahren konnte ein Protokoll etabliert werden, um PSU aus verschiedenen R. rubrum Stämmen routinemäßig zu isolieren. Diese können nicht nur bezüglich ihrer Zusammensetzung, Konformation oder Struktur untersucht, sondern auch zur Aufklärung des Energietransfermechanismus weiter analysiert werden.

The facultative photosynthetic bacterium Rhodospirillum rubrum belongs to the non-sulfur purple bacteria (Rhodospirillaceae). It is characterised by its versatile metabolism, which enables growth under either aerobic or anaerobic conditions or to perform an anaerobic anoxygenic photosynthesis. The R. rubrum cells produce the photosynthetic apparatus (PSA), which is embedded in specialised membranes derived from invaginations of the inner membrane and designated intracytoplasmic membranes (ICM) or, in isolated form, chromatophores. Expression of ICM is highly regulated by a signal transduction network of multiple components, which responds primarily to the oxygen partial pressure, but is also modulated by changes in light intensity. This bacterium produces ICM even in the dark as soon as the oxygen partial pressure drops below 1%. The main component of the PSA is the photosynthetic unit (PSU) consisting of a light-harvesting complex (LH1) and the photosynthetic reaction centre (RC). LH1 from R. rubrum has an hexadecameric structure consisting of heterodimeric a/b-polypeptide subunits, which bind two bacteriochlorophyll a (BChla) and one carotenoid molecule, respectively. Structural analysis at medium resolution revealed that the LH1 from R. rubrum encircles the RC in a closed conformation. The structure of the RC of R. rubrum is not yet solved, in contrast to the RCs of other species of purple bacteria for which high resolution data from X-ray crystallography are available. These latter data confirmed previous biochemical studies, which showed the RC to consist of three subunits, the H-, M-, and L-polypeptides, with the latter two binding all the cofactors needed for photosynthesis: 4 BChla, 2 bacteriophaeophytin, 2 ubiquinone molecules, one carotenoid and one iron atom. The function of the H subunit was defined only at a later date using biochemical, molecular biological and structural biological approaches. The results assigned the H-subunit to have an essential role in RC assembly and to participate in the primary process of photosynthesis. In previous studies from other groups deletion of the H-subunit resulted in the absence of functional RC, lack of photosynthetic growth and drastically reduced amounts of LH1 and ICM. In a previous study using R. rubrum, or other related photosynthetic bacteria, the strategy to obtain H-subunit deletion strains produced not only deletions in the gene encoding the H-subunit (puhA), but also in the flanking sequences of puhA. In recent studies, the multipartite structure of the H-subunit was analysed and the probable function of each domain was defined.

The present thesis contains following projects and goals: – A further characterisation of the H-subunit deletion mutants of R. rubrum, which were generated by a precise site-directed interposon mutagenesis. Finally, by comple-menting these strains to the wild-type phenotype, a deletion/complementation system was to be established. – Based on the above-mentioned system the putative H-subunit domains, indicated by molecular modelling, were to be experimentally characterised by site-directed mutagenesis. The goal was to generate a minimal domain of the H-subunit, which could restore the wild-type phenotype in the deletion strains. – The protocol present in our laboratory for the isolation and purification of PSU from R. rubrum was to be modified and optimised. A further goal was to establish a simpler method, than previously employed, for obtaining a high yield of pure PSU, avoiding large quantities of expensive chemicals. – The purified PSU from R. rubrum was to be characterised biophysical and biochemical techniques, and structural analysis to be performed for answering the question of LH1 geometry, the composition of the PSU and to also obtain structural data. The characterisation of H subunit deletion mutants performed in this study revealed that the reduced levels of LH1 and ICM due to the absence of the H-subunit could be circumvented by cultivation in high expression growth media containing a combination of carbon sources. Complementation of the deletion strains with a broad-host range vector carrying a fragment encoding solely the H-subunit completely restored the wild-type phenotype, thus establishing successfully the deletion/complementation system. The H-subunit was separated into two macrodomains by a sophisticated site-directed mutagenesis strategy. It is the first study so far, to show that co-expression of the separated domains still leads to a functional H-subunit and restores the wild-type phenotype in H-subunit deletion strains. Unexpectedly, both domains were able to assemble RC complexes when expressed singly in H-subunit deficient strains, so that we could define two different minimal domains of the H subunit sufficient to allow photosynthetic growth. The palette of plasmids and mutants generated in this study will also provide a number of new of further projects, to analyse the role of the H-subunit in the regulation of the PSA, and its influence upon the observed oxygen susceptibility of the mutant strains, respectively. The PSU purification strategy published previously could be simplified and optimised. A reduction of costs was achieved by changing the solubilising detergent and also the chromatography matrix employed. The application of this new protocol with amounts of chromatophores equivalent to those used previously with the published procedure, showed an increased yield of purified PSU by up to 10-fold. The analysis of the PSU preparations by either spectroscopy or SDS-PAGE showed them to be identical to those obtained using the previous protocol. Proteins of the purified PSU were identified by amino acid sequencing using mass spectrometry. This is the first study to analyse components of isolated PSU by this technique. In addition to the expected proteins of the RC and LH1, a protein of the outer membrane, Porin41, was found in the PSU preparation. Our biochemical analysis indicated, that this porin is tightly associated with the PSU. In future projects it should be established if the binding of Porin41 to the RC is an artefact due to the isolation and purification protocol applied or whether the association has a physiological role. The LH1 geometry of the PSU was examined by single molecule fluorescence spectroscopy. The results indicated clearly that the LH1 surrounding the RC is present in a circularly symmetric conformation. This result was obtained for both detergent-solubilised PSU and also for PSU reconstituted into lipid vesicles. In contrast to these findings, studies performed by other groups have indicated that the LH1 in their PSU preparations is present in an elliptical conformation. Our results, performed using PSUs diluted in lipid bilayers, suggest that the elliptical deformation in the latter studies is mainly due to packing effects within 2D crystals, or that the detergent used for isolation leads to partial dissociation of the complex. Two-dimensional crystallisation of the PSU was optimised so that a procedure was established for obtaining crystals of reproducible quality. By further optimisation steps, the attainable resolution of the crystals will probably be enhanced. The higher amount of protein using the new developed protocol now allows also three-dimensional crystallisation trials to be feasible. Finally, the new protocol for the isolation and purification of PSU established a method, which allows the extraction of PSU from various R. rubrum mutants to be done routinely. Not only the aspects of composition, conformation or structure but also the analysis of energy transfer mechanism within the complex will be of great interest.