Gene Silencing und das Abutilon-Mosaik-Virus

Abstract

Geminiviren richten weltweit einen großen ökologischen und ökonomischen Schaden an. Es gibt ein gesteigertes Interesse, Pflanzenpathogenen entweder durch konservative Mittel oder durch biotechnologische Nutzung von neuentdeckten Phänomenen, wie dem Post-transcriptional Gene Silencing (PTGS) Einhalt zu gebieten. Dies ist vielversprechend, weil PTGS ein pflanzeneigenes Abwehrsystem gegen Pathogene darstellt, das ubiquitär im Pflanzenreich verbreitet ist. Verschiedene PTGS-Auslöser zur Unterdrückung von Geminivirusinfektionen sollten hergestellt und charakterisiert werden. Dazu sollten Silencing-Konstrukte gegen eine Abutilon Mosaic Virus (AbMV)-Infektion entwickelt und eingesetzt werden, um letztendlich Wirtsfaktoren zu charakterisieren, die für eine geminivirale Infektion essentiell sind, zugleich aber die Wirtspflanze nicht in ihrer Entwicklung hemmen. Die DNA des AbMV wurde dazu als Gene Silencing- und Proteinexpressionsvektor umkonstruiert und mit Hilfe des Markergens Phytoendesature (PDS) und des Reportergens Green Fluorescence Protein GFP funktionell überprüft. In die infektiöse Hüllprotein-Deletionsmutante von AbMV wurde ein cDNA-Fragment von Phytoendesaturase (PDS) inseriert. Inokulierte Nicotiana benthamiana-Pflanzen zeigten im Verlauf der Infektion den erwarteten Albino-Phänotyp, der durch PDS-Silencing entsteht. Der offene Leserahmen (ORF) von GFP wurde in die gleiche AbMV-Mutante inseriert und führte zur Expression von GFP unter der Kontrolle des Hüllprotein-Promotors sowohl in Agrobakterium-infiltriertem Gewebe, als auch in systemisch infizierten Geweben, so dass AbMV als Gene Silencing- und Proteinexpressionsvektor genutzt werden kann. Im Hefe-2-Hybrid-System konnte Dr. T. Kleinow nachweisen, dass die N-terminale Domäne des movement protein (MP) von AbMV mit dem C-terminalen Bereich des Chloroplasten-lokalisierten Hitzeschock-Proteins von 70 kDa (cpHsc70) aus Arabidopsis thaliana interagiert. Um zu überprüfen, wie sich ein cpHsc70-knock down Phänotyp auf eine AbMV-Infektion auswirkt, wurde das etablierte AbMV-basierte Silencing-Vektorsystem genutzt. Als Silencing-Phänotyp konnten entlang der Leitgewebe systemisch infizierter N. benthamiana-Blätter kleine weiße Chlorosen beobachtet werden, die auf die Degradation der Chloroplasten zurückgeführt werden konnten. In cpHsc70-gesilencten Pflanzen akkumulierte zudem signifikant weniger single-stranded DNA (ssDNA), als in den Kontroll-Proben, so dass über einen Effekt von cpHsc70-silencing auf virale ssDNA spekuliert werden kann. Eine Interaktion von cpHsc70 mit dem AbMV-Transportkomplex als Grundlage für den Transport von geminiviraler DNA über Membranen wird diskutiert. Über die Eigenschaften des AbMV Transkriptions-Transaktivator Proteins (TrAP) als Silencing-Suppressor ist noch nichts bekannt. Die Funktion als Silencing-Suppressor oder dessen Interferenz mit der Silencing-assoziierten Maschinerie sollte charakterisiert werden, um gezielt Resistenz oder Toleranz zu etablieren. Eine GFP-Expressionskassette wurde zwischen zwei virale Replikationsursprünge inseriert und stabil in eine N. benthamiana-Pflanze als Transgen integriert, so dass durch Infektion mit AbMV ein Transreplikon aus dem Transgen mobilisiert werden konnte, das GFP exprimiert. In AbMV-infizierten Pflanzenzellen konnten GFP-Signale im Leitgewebe beobachtet werden und bestätigten damit die Mobilisierung und Replikation des Transreplikons. In Infiltrationsexperimenten mit Agrobakterien, die die Expression des AbMV Replikation-assoziiertem Proteins (Rep) und TrAP vermitteln, konnte gezeigt werden, dass die Mobilisierung des Transreplikons ausschließlich Rep-induziert ist. Während die Co-Expression von Rep und TrAP, genauso wie Agrobakterium-vermittelte Transfektion mit dem infektiösen AbMV DNA A Plasmid, die Mobilisierung des Transreplikons unterdrückt. Das gut charakterisierte Silencing-Suppressor Protein p19 des Cymbidium ringspot virus, eines nicht verwandten RNA Virus, neutralisierte diesen Effekt, so dass von einer siRNA-vermittelten Unterdrückung der Transreplikation ausgegangen werden konnte. Durch Darstellung der Topoisomere der viralen DNA konnte auf verschiedene Kondensierungszustände geminiviraler Minichromosomen geschlossen werden. Für AbMV konnte festgestellt werden, dass das Chromatin mit fortschreitender Infektionsdauer kondensierter und damit möglicherweise Transkriptions-inaktiver wird. Eine Überexpression von TrAP inhibierte diesen Effekt, was auf eine chromatinmodulierende Eigenschaft hinweist, während eine Funktion als Silencing-Suppressor eher unwahrscheinlich ist.

In recent years, geminiviruses have emerged as leading plant pathogens that cause severe crop losses worldwide. They infect a broad range of plant species, including tomatoes, cucurbits, cassava, maize, beans and cotton. Many attempts to generate geminivirus resistance have met with limited success. As a consequence, it is essential to develop new resistance strategies and to understand viral counterdefense mechanism. RNA interference (RNAi), also called post-transcriptional gene silencing (PTGS), is a sequence-specific RNA degradation mechanism that silences a targeted gene. It is part of the natural virus defence system, whereas transcriptional gene silencing (TGS) is thought to be a defence against transposons or other invasive DNA elements. In addition, RNAi is a powerful tool for elucidating gene functions. We have developed a system based on the bipartite geminivirus Abutilon mosaic virus (AbMV) to identify host factors essential for viral infectivity. As a proof of concept, we replaced the AbMV coat protein gene by a fragment of the Nicotiana benthamiana phytoene desaturase (PDS) gene. Extensive PDS silencing was produced during further growth of inoculated plants. To use AbMV as a versatile tool to study gene function in vivo, it is desirable to use it simultaneously as a virus-based plant expression vector for foreign proteins. Plant virus-based vectors as transient gene expression systems are an attractive alternative to conventional breeding and transformation technology. Therefore, the open reading frame (ORF) of mGFP4 was inserted in place of the coat protein, leading to GFP signals in infected cells, giving the opportunity for online monitoring of virus movement through distal parts of a plant, and studying tissue specificity. The analysis confirmed that AbMV existed in tissues no other than the internal and external phloem of vascular bundle. The C-terminal portion of Arabidopisis thaliana cpHsc70-1 was found to interact with the N-terminal region of Abutilon mosaic virus (AbMV) movement protein in a yeast two hybrid assay (Dr. T. Kleinow, pers. communication). Therefore a geminivirus-based gene silencing vector harboring the cpHsc70-fragment was constructed to silence the nuclear encoded and chloroplast-localized heat shock protein of 70 kDa (cpHSC70) in N. benthamiana plants. Systemically infected leaves showed punctated photo-bleached areas similar to those induced by phytoene desaturase (PDS) silencing indicating an interference with chloroplast stability. CpHsc70-silenced plants accumulated less viral DNA, in particular single-stranded DNA (ssDNA), than PDS-silenced or AbMV-infected plants. An involvement of cpHSC70 in geminiviral movement is discussed. An AbMV-based transreplicon was constructed to monitor infection and to identify plant tissues specificity. A green fluorescent protein (GFP) expression cassette driven by the constitutive 35S promoter of Cauliflower mosaic virus (CaMV) was embedded in a truncated AbMV DNA A partial dimer and transferred to N. benthamiana plants as a transgene. Upon AbMV infection, the transreplicon was released and resulted in GFP overexpression. Agroinfiltration of these transgenic plants with a construct that expressed the AbMV replication-associated protein Rep (or AC1) alone showed, that Rep is necessary and sufficient to induce bright GFP fluorescence in the infiltrated area. Co-expression of AbMV Rep and TrAP ( or AC2), a protein that has been identified as transcriptional transactivator as well as silencing suppressor protein for other begomoviruses, surprisingly suppressed transgene transreplication. This effect however, was neutralized by the strong p19 silencing suppressor of the unrelated, RNA-containing Cymbidium ringspot virus (CymRSV) suggesting an involvement of small interfering RNA (siRNA). In order to investigate whether TrAP has an influence on the viral chromatin condensation as a response to silencing, the distribution of topoisomers of monomeric viral circular double-stranded DNA at different stages of infection was visualized. Transreplicon and viral minichromosomes were found to exist in structures dependent on Rep and/or TrAP expression. The topoisomers distribution pattern indicated the influence of AbMV TrAP in altering viral chromatin conformation, whereas suppression of transcriptional gene silencing (TGS) can presumably be excluded.