Expressionsoptimierung und Produktion von Haloalkan-Dehalogenasen zur Umsetzung von 1,2,3-Trichlorpropan

Abstract

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Herstellung von Haloalkan Dehalogena-sen zur biokatalytischen Umsetzung des prochiralen 1,2,3 Trichlorpropan zu dem (R) oder (S) Enantiomer des 2,3-Dichlor-1-propanol. Die Bereitstellung dieser En-zyme schließt sowohl eine Optimierung der heterologen Proteinexpression im jewei-ligen Wirtsorganismus, als auch die Produktion und Aufreinigung des Biokatalysa-tors ein. Die von der Firma DOW Chemicals bereitgestellten Haloalkan Dehalogenasen un-terscheiden sich im Wesentlichen hinsichtlich ihrer ee-Werte bezüglich des Produkts 2,3-Dichlor-1-propanol und im Hinblick auf ihr Expressionsverhaltens in Escherichia coli. Für die aus einem Bodenscreening stammenden Haloalkan Dehalogenasen DSD4 und DSD49 wird auf Grundlage von experimentellen Ansätzen das intrazellu-läre Expressionsniveau dieser Proteine signifikant erhöht. Weiterhin werden auf Grundlage von modellgestützen Ansätzen Ursachen für die Bildung von "Inclusion bodies" während der heterologen Expression dieser Haloalkan Dehalogenasen her-ausgearbeitet. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der fermentativen Produktion von Ha-loalkan Dehalogenasen in E. coli über eine Hochzelldichte- Kultivierung im 30 l Maßstab und dem anschließenden Downstream-Prozess der Biokatalysatoren. Das Ziel dieses Arbeitsschwerpunkts liegt darin, den Biokatalysator im halbtechnischen Maßstab möglichst kostengünstig und innerhalb kurzer Zeit herzustellen. Für die Etablierung des Gesamtprozesses wird eine Haloalkan Dehalogenase aus Rhodo-coccus rhodochrous (DhaA) eingesetzt. DhaA weist gegenüber den DSD Varianten bezüglich des Produkts eine geringere Enantioselektivität auf, zeichnet sich aber bereits zu Beginn der Arbeit durch ein hohes Expressionsniveau in dem Wirtsorga-nismus E. coli aus. Innerhalb des Downstream- Prozesses wird die "High Gradient Magnetic Fishing"-Technik eingesetzt. Dieses Verfahren ermöglicht, wesentliche Schritte eines klassischen Chromatographie-Aufreinigungsverfahrens zu umgehen, was zu einer Kosten- und Zeitersparnis führt. Mit Hilfe der Magnettrenntechnik lässt sich der Downstream-Prozess für Haloalkan Dehlogenasen auf die drei Arbeits-schritte des Zellaufschlusses, der Affinitätsaufreinigung mittels HGMF und der Kon-ditionierung des Biokatalysators über eine Ultrafiltration reduzieren.

The work presented here focuses on the production of haloalkane dehalogenases for the conversion of prochiral 1,2,3-trichloropropan into the (R) or (S) enantiomere of 2,3-dichloro-1-propanol. This includes the optimization of the heterologous protein expression for the haloalkane dehalogenases in different host organisms as well as the production and downstream process of the biocatalysts. Haloalkane dehalogenases provided by DOW Chemicals differ mainly in their ee values towards the product 2,3-dichloro-1-propanol and in their expression be-haviour in the host organism Escherichia coli. The intracellulare expression level of two of these haloalkane dehalogenases DSD4 and DSD49, derived from a soil based screening, was significantly improved by experimental approaches during cul-tivation. More causes for inclusion-body-formation during heterologous protein ex-pression are pointed out by model based methods. The second part of this work deals with the production of haloalkane dehalogenases in E. coli by high cell density (HCD) cultivation in a 30 l scale followed by down-stream processing of the biocatalysts. The aim of this workscope is the production of the enzyme in large scale in a cost- and time- saving manner. The whole process is established by a haloakane dehalogenase from Rhodococcus rhodochrous (DhaA). In comparison with DSD variants DhaA has a lower enantioselectivity to-wards the product 2,3-dichloro-1-propanol, but the enzyme shows a high expression level as well as little inclusion body formation in E. coli right from the beginning of this work. Along with downstream processing a method called "high gradient magnetic fishing" (HGMF) separation is integrated. The HGMF operation allows re-duction of purification steps necessary when fixed bed columns are used for protein purification. In this way saving of costs and time can be achieved. By including the magnetic separartion technique, the downstream process of haloalkane dehalo-genases can be reduced into three purification steps: (1) Cell disruption by glass bead mill, (2) affinity protein purification via the HGMF technique and (3) condition-ing of the biocatalyst by ultrafiltration.