Immobilisierung von Haloalkan-Dehalogenasen und Prozessentwicklung der enzymatischen Produktion von optisch aktivem 2,3-Dichlor-1-propanol

Abstract

Für die enzymatische Dehalogenierung von 1,2,3-Trichlorpropan zu optisch aktivem 2,3-Dichlor-1-propanol wurden im Rahmen dieser Arbeit die kovalente Immobilisierung mit dem Enzymträger Eupergit modelliert, die enzymkinetische Charakterisierung der eingesetzten Haloalkan-Dehalogenasen durchgeführt, ein detailliertes Festbettreaktormodell erarbeitet, eine vollautomatisierte Versuchsanlage zur Modellvalidierung und Prozessoptimierung entworfen, gebaut und betrieben, das Langzeitaktivitätsverhalten der beiden Haloalkan-Dehalogenasen untersucht sowie eine Bewertung der eingesetzten Immobilisierungsmethoden vorgenommen.

Die Eupergit-Immobilisierung von Haloalkan-Dehalogenase DhaA wurde durch ein kinetisches Modell beschrieben, das aufgrund der Abwesenheit diffusiver Limitierungen die Phänomene Inaktivierung des löslichen Enzyms und Immobilisierungsreaktion in einphasiger Weise beschreibt und einer analytischen Lösung zugänglich ist. Die experimentelle Überprüfung offenbarte eine ausreichende Vorhersagegüte des Modells. Aufgrund der stärkeren thermischen Aktivierung der Immobilisierungsreaktion gegenüber der Enzyminaktivierung führt eine Absenkung der Immobilisierungstemperatur zu sowohl geringeren Enzym-Ausbeuten als auch niedrigeren Raum-Zeit-Ausbeuten der Immobilisierung. Die Ausbeute an aktiv immobilisiertem Enzym kann durch den Einsatz hoher Eupergit-Konzentrationen gesteigert werden. Der Einfluss der Eupergit-Konzentrationen bei der Immobilisierung auf die Reaktorgröße des Syntheseprozesses konnte quantifiziert werden.

Die enzymkinetische Beschreibung der Haloalkan-Dehalogenasen DhaA und DSD4, die durch eine Michaelis-Menten-Kinetik mit kompetitiver Produktinhibierung sowohl temperatur- als auch pH-abhängig vorgenommen wurde, konnte die unterschiedlichen katalytischen Eigenschaften der Enzyme offen legen. Haloalkan-Dehalogenase DhaA zeichnet sich durch eine hohe Affinität zu Substrat und Produkt der betrachteten Dehalogenierung aus (K_M(30°C, pH 9) = 1,79 mmol/l, K_I(30°C, pH 9) = 1,56 mmol/l), während das Enzym DSD4 sowohl eine geringere Substrat- als auch Produktaffinität aufweist (K_M(30°C, pH 9) = 9,96 mmol/l, K_I(30°C, pH 9) = 25,6 mmol/l). Auf Basis der kinetischen Daten konnte ein Festbettreaktor als der ideale Reaktortyp für die enzymatische Produktion von optisch aktivem 2,3-Dichlor-1-propanol identifiziert werden.

Zur Beschreibung des Festbettreaktors wurde ein detailliertes Modell entwickelt, das zwei Kompartimente unterscheidet und die Phänomene Konvektion, Dispersion, Stofftransport, Diffusion, Adsorption und Reaktion berücksichtigt. Die benötigten Parameterwerte wurden teilweise experimentell bestimmt oder empirischen Korrelationen aus der wissenschaftlichen Literatur entnommen. Das zur Erzielung höherer Produktkonzentrationen erarbeitete Konzept eines Rückführungsprozesses wurde ebenfalls adäquat modelliert.

Miniplant-Experimente der immobilisierten Haloalkan-Dehalogenasen DhaA und DSD4 zeigten eine gute Übereinstimmung der experimentellen Beobachtungen und den Simulationsergebnissen. Die Konzentrationsprofile im Festbettreaktor von Fließgleichgewichtsexperimenten werden in erster Linie von den enzymkinetischen Parametern bestimmt, während das dynamische Reaktorverhalten nach einer sprunghaften Änderung der Zulaufbedingungen erheblich von der Substrat- und Produktadsorption am Enzymträger abhängt. Bei den experimentellen Beobachtungen der Prozessvariante mit Rückführung wurde eine Nebenproduktbildung beobachtet, die die Prozessbeschreibung durch das Modell aufgrund zusätzlich verbrauchter Lauge erschwert. Im Falle geringer Nebenproduktbildung kann die Abweichung toleriert und die Vorhersage der zeitlichen Konzentrationsverläufe durch das Modell als ausreichend bezeichnet werden. Die erzielte Raum-Zeit-Ausbeute des Prozesses mit Rückführung entspricht in etwa der des kontinuierlich betriebenen Festbettreaktors bei gleichem Umsatz.

Modelling of the covalent immobilization onto the enzyme carrier Eupergit, kinetic characterization of the applied haloalkane dehalogenases, detailed fixed bed reactor modelling, design, assembly and operation of a fully-automated mini-plant, long-term activity studies of the haloalkane dehalogenases, as well as a comparative assessment of the two involved immobilization methods was undertaken in the context of this work for the enzymatic dehalogenation of 1,2,3-trichloropropane to optical active 2,3-dichloro-1-propanol.

The immobilization of haloalkane dehalogenase DhaA onto Eupergit was described by a simple single phase model which in the absence of diffusional limitations accounts for the phenomena inactivation of the soluble enzyme and immobilization reaction and which can be solved analytically. Experimental validation exhibited a sufficient prediction accuracy of this model. Due to a higher thermal activation of the immobilization reaction compared to enzyme inactivation, a decrease of immobilization temperature leads to lower enzyme yields as well as lower space time yields of the immobilization. The yield of active immobilized enzyme can effectively be increased through applying high Eupergit concentrations. The influence of the Eupergit concentration during immobilization on the reactor size of the synthesis process could be quantified.

The kinetic characterization of the haloalkane dehalogenases DhaA and DSD4, which was achieved by a temperature and pH-dependent Michaelis-Menten type of kinetics involving competitive product inhibition, revealed the different catalytic properties of the two enzymes. Haloalkane dehalogenase DhaA exhibits a strong affinity towards substrate and product of the studied dehalogenation (K_M(30°C, pH 9) = 1,79 mmol/l, K_I(30°C, pH 9) = 1,56 mmol/l), while the DSD4 enzyme shows a lowered affinity towards the two molecules (K_M(30°C, pH 9) = 9,96 mmol/l, K_I(30°C, pH 9) = 25,6 mmol/l). Based on these results the fixed-bed reactor could be identified as the ideal type of reactor for the enzymatic production of optically active 2,3-dichloro-1-propanol.

For the description of the fixed-bed reactor a detailed model was developed which distinguishes between two compartments and incorporates the phenomena convection, dispersion, mass transfer, diffusion, adsorption, and reaction. The required parameters were determined partly by experiments or were taken from empirical correlations found in the scientific literature. The concept of a loop process for the achievement of high product concentrations was also adequately modelled.

Mini-plant experiments with the immobilized haloalkane dehalogenases DhaA and DSD4 showed a good agreement of experimental observations and simulation results. The steady-state concentration profiles within the fixed-bed reactor are predominantly influenced by the enyzme kinetic parameters, whereas the dynamic reactor behaviour after a stepwise alteration of the feed conditions depends mainly on the adsorption of substrate and product onto the enzyme carriers. During the experiments in the loop configuration a by-product formation was observed which severely hindered the process description by the model due to an increased consumption of base. For minor by-product formation the deviation can the tolerated and prediction of the concentration time courses by the model can be regarded as sufficient. The attained space time yield of the loop process corresponds approximately to the space time yield of the conventional fixed-bed process at the same conversion.

The inactivation of the immobilized haloalkane dehalogenases was investigated in long-term studies under continuous process condition in the mini-plant. Eupergit-immobilized enzyme DhaA exhibited an activity loss of approx. 12 % after an operation period of 14,3 days at an fixed-bed reactor temperature of 30°C. Due to the comparative high scattering of the activity data, the determined half life of 74,5 days can be regarded as doubtful. PEI-alumina immobilized haloalkane dehalogenase DhaA was evaluated for its long term stability in five experimental series at three different fixed-bed temperatures. An additional inactivation due to non-dissolved substrate during two experimental series avoided the identification of the enzyme's thermal inactivation mechanism and its model-based description. By means of the raw data, the inactivation can be qualitatively estimated. After around 100 days of mini-plant operation an decrease in activity of PEI-alumina immobilized haloalkane dehalogenase of approx. 80 % was observed. The long-term stability of PEI-alumina immobilized haloalkane dehalogenase DSD4 is not sufficient for industrial applications because during the first week of continuous mini-plant operation an activity loss of approx. 75 % occurred.

Comparing the two immobilization methods applied in this work, Eupergit is advantageous over PEI-alumina in terms of its easier immobilization procedure as well as its assumed higher protection against inactivation during continuous operation. Immobilization of haloalkane dehalogenases onto PEI-alumina benefits through conserving enzyme activity over immobilization and through enabling short dynamic transition phases after changed process conditions. Internal mass transfer considerations, which would favour Eupergit, do not play a decisive role with the used enzymes due to their low activity. It was resigned from assessing the immobilization methods conclusively since the inactivation patterns of the immobilized enzymes could not sufficiently be determined.