Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.18419/opus-1821
Authors: Messerschmidt, Sylvia
Title: Targeted lipid coated nanoparticles : delivery of tumor necrosis factor functionalized particles to tumor cells
Other Titles: Zielgerichtete lipidverpackte Nanopartikel : Transport von Tumor Nekrose Faktor (TNF) funktionalisierten Partikeln zu Tumorzellen
Issue Date: 2009
metadata.ubs.publikation.typ: Dissertation
URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-45144
http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/1838
http://dx.doi.org/10.18419/opus-1821
Abstract: Polymeric nanoparticles become more and more important as versatile carrier systems for therapeutic and diagnostic compounds embedded within the particle matrix or attached to the particle surface through physical or covalent bonds. Nanoparticle displaying tumor necrosis factor (TNF) on their surface, efficiently activate both TNF receptors and thus mimic the bioactivity of membrane-bound TNF. This leads to a strikingly increased apoptosis. However, an in vivo application for cancer therapy is hampered by the potential systemic action of TNF, which can lead to severe side effects and even death. In this study, targeted lipid-coated TNF-functionalized nanoparticles (scTNF-TLP) were generated, which may be a promising formulation of TNF enabling a systemic and tumor selective application. ScTNF-TLP are composed of an inner polymeric core with a surface that is functionalized with a single-chain TNF derivative (scTNF). The particles are surrounded by a sterically stabilized polyethylene glycol (PEG)-lipid coat. Thus a strong reduction of the cytotoxic effect could be achieved which indicates an effective shielding of the TNF activity. By insertion of a single-chain Fv fragment (scFv) directed against the tumor stroma marker fibroblast activation protein (FAP) an active targeting could be demonstrated. The insertion of the targeting moiety into the lipid coat was achieved by a defined and site-directed coupling through a genetically engineered cysteine residue. In order to improve the scFv format for coupling a comparative analysis of various newly designed variants was performed. The most suitable variants contain the hexahistidyl-tag for purification and detection incorporated into the linker sequence together with a cysteine residue (LCH). The resulting TLP and scTNF-TLP bound specifically to FAP-expressing cells but not to FAP-negative cells. The lipid-coating strongly reduced the unspecific uptake of particles and also the scTNF-P mediated apoptosis. In contrast, an increased cytotoxicity towards FAP-expressing cells could be shown for anti-FAP scTNF-TLP compared to lipid-coated scTNF-P without targeting molecule. This indicates a selective delivery of the embedded TNF-functionalized nanoparticle to antigen-positive target cells. In summary, by encapsulation into a multifunctional lipid-shell, polymeric and TNF-functionalized nanoparticles, which are subject to an unspecific activity towards a variety of cells and tissue, could be converted in a targeted lipid-coated nanoparticulare carrier system and demonstrated a target cell-specific action of the bioactive compound. This system benefits from a large modularity: beyond the bioactive compound also the targeting moiety as well as the inner core could be adapted at the current requirements. Thus, a manifold application as imaging or drug carrier system is conceivable. Moreover, a combination of both approaches enables usage for a diagnostic as well as therapeutic application.
In der letzten Zeit gewinnen polymere Nanopartikel immer mehr an Bedeutung als vielseitige Trägersysteme für therapeutische und diagnostische Komponenten. Diese können innerhalb der Partikelmatrix eingebettet oder auf den Partikeloberflächen mittels chemischer oder physikalischer Verbindung verankert sein. Für Nanopartikel, welche mit dem Tumor Nekrose Faktor (TNF) oberflächenmarkiert sind, konnte eine wirkungsvolle Aktivierung von beiden TNF Rezeptoren gezeigt werden. Sie ahmen somit mebrangebundenes TNF nach. Dadurch wird eine deutliche Zunahme des programmierten Zelltodes, der Apoptose, erzielt. Eine in vivo Anwendung in der Krebstherapie ist jedoch aufgrund des potentiellen systemischen Potentials von TNF nicht möglich. Verabreichung von TNF kann zu massiven Nebeneffekten und sogar zum Tode führen. In dieser Arbeit wurden zielgerichtete lipid-verpackte, mit TNF funktionalisierte Nanopartikel (scTNF-TLP) hergestellt, welche einen vielversprechenden Ansatz für eine systemische und tumor-spezifische Anwendung darstellen. Ein scTNF-TLP besteht aus einem inneren polymeren Nanopartikel, welcher mit einem einzelkettigen TNF Derivat (scTNF) funktionalisiert ist. Die umgebende Lipidhülle wird mittels Polyethylenglycol (PEG) sterisch stabilisiert. Auf diese Weise wird eine deutliche Reduktion in der Toxizität der scTNF-P erreicht. Dies deutet auf eine effektive Abschirmung der TNF Aktivität hin. Für ein aktives Targeting wurde ein single-chain Fv Fragment (scFv), welches gegen den Tumor Stroma Marker fibroblast activation protein (FAP) gerichtet ist, in die Lipidhülle integriert. Die Insertion der scFv Moleküle erfolgte über eine definierte und zielgerichtete Kopplung mittels eines zusätzlichen, gentechnologisch eingefügten Cysteins. Zur Verbesserung des Formats des scFv Moleküls wurden mehrere neuartige Varianten untereinander verglichen. Als am meisten geeignet erwiesen sich die sog. LCH Varianten, bei denen zusätzlich zum Cystein-Rest, ein zur Aufreinigung und Detektion verwendeter Hexahistidyl-Tag innerhalb der Linkersequenz integriert wurde. Die resultierenden TLP wie auch scTNF-TLP zeigten eine spezifische Bindung an FAP-exprimierende nicht aber an FAP-negative Zellen. Außerdem konnte durch eine Umhüllung mit Lipid die unspezifische Bindung von Partikeln, sowie die von scTNF-Partikeln vermittelte Apoptosis stark reduziert werden. Im Gegensatz dazu wiesen scTNF-TLP eine erhöhte Zytotoxizität für FAP-positive Zellen relativ zu lipid-verpackten scTNF-Partikeln ohne Targeting Molekül auf. Dies spricht für einen selektiven Transport des enthaltenen, mit TNF funktionalisierten Partikels zu Zellen mit dem entsprechenden Antigen. Es war somit möglich polymere und mit TNF funktionalisierte Nanopartikel, die sich durch eine unspezifische Aktivität gegenüber einer Vielzahl von Zell- und Gewebearten auszeichnen, durch die Verpackung in eine multifunktionale Lipidhülle in ein zielgerichtetes lipid-umhülltes nanopartikuläre Trägersystem umzuwandeln. Dieses System zeichnet sich durch eine zielzell-spezifische Wirkung der bioaktiven Komponente aus. Die Vorteile dieses Trägersystems liegen in der großen Modularität: Neben der bioaktiven Komponente können sowohl der innere Kern als auch das Targeting an die jeweiligen Anforderungen angepasst werden. Somit ist eine vielfältige Anwendung in der Bildgebung oder als Trägersystem für Wirkstoffe denkbar. Darüber hinaus kann durch eine Kombination der beiden Ansätze eine gleichzeitige Verwendung im diagnostischen und im therapeutischen Bereich erreicht werden.
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