Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.18419/opus-1824
Authors: Rothdiener, Miriam
Title: Targeted siRNA carrier systems for the treatment of acute myeloid leukaemia (AML)
Other Titles: Zielgerichtete siRNA-Trägersysteme für die Behandlung der akuten myeloischen Leukämie (AML)
Issue Date: 2009
metadata.ubs.publikation.typ: Dissertation
URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-46315
http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/1841
http://dx.doi.org/10.18419/opus-1824
Abstract: Active targeting is an important prerequisite for selective administration of therapeutic agents into tumour cells. In acute myeloid leukaemia (AML) a targeted drug delivery via antibody fragments directed against CD33 can be reached. CD33 is an internalizing receptor expressed on the surface of myeloid blasts. Several variants of recombinant anti-CD33 single chain Fv (scFv) fragments differing in the order of their variable domains (VHVL or VLVH) were expressed. Immunoliposomes (ILs) were generated by conventional coupling to malPEG2000-functionalized liposomes and by postinsertion of scFv-coupled micelles into preformed PEGylated liposomes, respectively. The exclusively high binding activity of anti-CD33 ILs with scFv molecules in the VHVL configuration is remarkable and provides evidence of a possible influence of domain order on binding activity. ILs containing 0.3 mol% of scFv-coupled lipid showed the highest binding and uptake activity on target cells. Binding activity remained constant for several days and required only a few scFv molecules per liposome. SiRNA was encapsulated passively, either as naked siRNA, or complexed with polyethylenimine (PEI) or protamine with loading efficiencies between 24 and 100 %. ILs had a diameter of approximately 130 to 140 nm after encapsulation of siRNA. In addition, immunopolyplexes (IPPs) were generated by coupling of scFv CD33 VHVL to the synthetic polymer PEI, forming complexes with siRNA. Size of IPPs was very heterogenous and ranged from 180 to 450 nm, with a slightly negative surface charge. Target cell specific binding and uptake of both carrier systems could be shown by flow cytometry and fluorescence microscopy studies. Transfection of the carrier systems and silencing of the target leukaemic fusion gene AML1/MTG8 by encapsulation of a specific siRNA showed a selective, quantitative silencing of AML1/MTG8 on protein level. Knockdown of AML1/MTG8 expression led to a decreased cell clonogenicity, demonstrated in colony formation assays. However, observed target gene knockdown effects were not very pronounced and, depending on the concentration of the carrier system, knockdown could also be insufficient or unspecific caused by a narrow window between inefficient and unspecific or even cytotoxic concentrations. Furthermore, a stimulating effect of ILs on the clonogenicity of the target cells was observed. In the present study, basic procedures for the targeted delivery of siRNA via ILs and IPPs were established, which should be improved by further approaches. As a first step towards therapeutic applications, humanization of the murine scFv VHVL molecule via CDR-grafting was performed, resulting in a humanized scFv with identical binding properties and improved stability.
Aktives Targeting ist eine wichtige Voraussetzung für die selektive Verabreichung therapeutischer Agenzien in Tumorzellen. In der akuten myeloischen Leukämie (AML) kann eine zielgerichtete Wirkstoffverabreichung über Antikörperfragmente, die gegen CD33 gerichtet sind, erreicht werden. CD33 ist ein internalisierender Rezeptor, der auf der Zelloberfläche myeloischer Blasten exprimiert wird. Mehrere verschiedene Varianten rekombinanter anti-CD33 single chain Fv (scFv) Fragmente, die sich in der Anordnung ihrer variablen Domänen unterscheiden (VHVL bzw. VLVH), wurden produziert. Immunliposomen (IL) wurden mit Hilfe der konventionellen Kopplung an malPEG2000-funktionalisierte Liposomen oder durch die Postinsertion von scFv-gekoppelten Micellen in vorgeformte PEGylierte Liposomen hergestellt. Bemerkenswert ist die ausschließliche, starke Bindungsaktivität der anti-CD33 IL, die mit scFv Molekülen in der VHVL Konfiguration gekoppelt wurden. Dies weist auf einen möglichen Einfluss der Anordnung der Domänen auf die Bindungsaktivität der IL hin. IL mit 0,3 mol% scFv-gekoppelten Lipids zeigten die höchste Bindungsaktivität und Aufnahme in Zielzellen. Die Bindungsaktivität blieb über mehrere Tage stabil und erforderte nur wenige scFv Moleküle pro Liposom. Liposomen wurden passiv mit siRNA beladen, entweder in freier Form oder als Komplex mit Polyethylenimin (PEI) oder Protamin. Die Beladungseffizienz variierte zwischen 24 und 100 %. Die IL wiesen eine Größe von 130 bis 140 nm nach siRNA Beladung auf. Zusätzlich zu IL wurden Immunopolyplexe (IPP), durch Kopplung von scFv CD33 VHVL an das synthetische Polymer PEI und siRNA-Komplexierung, hergestellt. Die Größen der IPP waren sehr heterogen und reichten von 180 bis 450 nm bei leicht negativer Oberflächenladung. Zielzellspezifische Bindung und Aufnahme konnte für beide Trägersysteme in der Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie gezeigt werden. Transfektion der Trägersysteme und Silencing des leukämischen Fusionsgens AML1/MTG8 durch die Verpackung spezifischer siRNA zeigten ein selektives, quantitatives Silencing von AML1/MTG8 auf Proteinebene. AML1/MTG8 Knockdown führte zu einem verminderten Proliferationspotential, das im Colony Formation Assay gezeigt werden konnte. Die beobachteten Knockdown-Effekte waren jedoch nicht sehr ausgeprägt und konnten, je nach Konzentration des Trägersystems, unzureichend oder unspezifisch sein, verursacht durch ein schmales Fenster zwischen Insuffizienz und Unspezifität oder gar Toxizität. Ein stimulierender Effekt der IL auf die Proliferation der Zielzellen wurde gezeigt. In dieser Arbeit wurden die Grundlagen für eine zielgerichtete Verabreichung von siRNA über IL und IPP geschaffen, die in weiteren Ansätzen verbessert werden sollten. Ein erster Schritt in Richtung therapeutischer Anwendung, wurde durch die Humanisierung des murinen scFv VHVL Moleküls mittels CDR-grafting gemacht, was zu einem humansierten scFv mit identischen Bindungseigenschaften und verbesserter Stabilität führte.
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