Systems oriented analyses of hepatic 13C-labeling and metabolite dynamics

Abstract

In this thesis a data-driven model-based approach was undertaken to analyze the liver central metabolism at the systems-level. The work focused on the model-assisted interpretation of metabolome and fluxome data. Experimental observations of stationary and non-stationary 13C-labeling and metabolite data enabled the identification of metabolic fluxes, metabolite dynamics, and patterns of metabolic control by means of transient 13C-flux analysis, dynamic modeling, and metabolic control analysis. The major goals of this contribution were (i) to establish an experimental set-up and a computational framework for acquiring and analyzing transient 13C-mass fraction data in mammalian cells and to use it to identify metabolic fluxes in HepG2 cells, (ii) to apply transient 13C-flux analysis to quantify the effects of a therapeutic dose of the hypolipidemic drug atorvastatin on the cholesterol pathway and central metabolism in primary rat hepatocytes, and (iii) to provide systems-level analyses of the dynamics and control of the central carbon metabolism in hepatoma cells.

The experimental observation of the isotopic transient offers the temporal resolution needed to identify intracellular flux maps in mammalian cells from 13C-labeling experiments. To enable the estimation of metabolic fluxes from non-stationary 13C-labeling data in slow- and non-growing mammalian cell batch and fed-batch cultures, reliable means were provided for simultaneous quenching of metabolism and extraction of intracellular intermediates. The developed sampling procedures and chemical analyses were used to quantify metabolite levels and mass fractions in a dynamic labeling experiment with HepG2 cells using 13C-labeled glucose as substrate. In glycolysis and the pentose-phosphate pathway (PPP), isotopic steady state was reached within 30 min, whereas in the tricarboxylic acid (TCA) cycle isotopic steady state was not attained within 120 min. The experimental data were used to estimate the corresponding flux map. In order to identify the flux distribution, a computational framework was developed. The flux estimation was based on a large-scale stoichiometric model, which was used to estimate effluxes into the biomass, and an isotopomer model of glycolysis, the pentose-phosphate pathway, and the tricarboxylic acid cycle. The split ratio between glycolysis and the pentose-phosphate pathway was determined to 57 % and 43 %. It is worth noting that this was the first time metabolic fluxes were estimated in a mammalian system from a transient 13C-labeling experiment.

The effects of a therapeutic concentration of the hypolipidemic drug atorvastatin on cholesterol biosynthesis and central metabolism were determined in primary rat hepatocytes using 13C-labeled glutamine and transient 13C flux analysis. Isotopic steady state was observed within 4 h in the central metabolism but not in the cholesterol pathway, regardless of whether the hypolipidemic agent was administered or not. The flux through the cholesterol pathway was found to drop from 0.27 to 0.08 mmol/(lcv h) in response to the administration of the statin. Only minor differences were determined in the central carbon fluxes between cells treated with 50 nM atorvastatin and untreated cells. The flux control coefficient of the HMG-CoA reductase over the cholesterol synthesis flux was determined to 0.46, i.e. cholesterol biosynthesis is not completely controlled by the HMG-CoA reductase. This means that other reaction steps may be also potent targets for lowering blood cholesterol levels.

A dynamic liver central carbon metabolism model was developed from metabolite time-series and applied to break down the control hierarchy in hepatoma cells. The dynamic metabolite data were collected from HepG2 cells in a stimulus response experiment in which the cells had been deprived of extracellular glucose. The enzyme kinetics were described with the canonical linlog formalism, which had been reported previously to yield a good approximation quality, while only requiring the determination of comparatively few parameters. The in silico metabolite time-series data were in accordance with the experimentally determined metabolite dynamics. To unravel the internal control structure of the hepatoma central carbon metabolism, concentration and flux control coefficients, partial flux control coefficients, and internal response coefficients were deduced. The control patterns found support the hypotheses that the glucose-6-phosphate dehydrogenase reaction and the Warburg effect (cancer cells have an increased glycolytic flux in the presence of an adequate oxygen supply) are promising targets for tumor treatment.

In dieser Arbeit wurde ein datengetriebener modellbasierter Ansatz verfolgt, um den zentralen hepatischen Metabolismus auf Systemebene zu analysieren. Der Schwerpunkt lag dabei auf der modellgestützten Interpretation von Metabolome- und Fluxome-Daten. Die experimentelle Bestimmung von stationären und instationären Markierungs- und Metabolitdaten ermöglichte die Identifizierung von metabolischen Flüssen, Stoffwechsel-Dynamiken und metabolischen Kontrollprinzipien auf Basis von transienter 13C-Stoffflussanalyse, dynamischer Modellierung und metabolischer Kontrollanalyse. Die Hauptziele dieser Arbeite waren (i) die Etablierung eines experimentellen Set-ups und eines rechenbasierten Auswertungsrahmenwerks zur Erhebung und Analyse transienter Massenisotopomerdaten in Säugetierzellen und deren Einsatz zur Identifizierung metabolischer Flüsse in HepG2-Zellen, (ii) die Anwendung der instationären 13C Stoffflussanalyse zur Quantifizierung der Effekte einer therapeutischen Dosis des cholesterinsenkenden Medikaments Atorvastatin auf die Cholesterol-Synthese und den Zentralstoffwechsel in primären Rattenhepatozyten und (iii) die Untersuchung der Dynamik und Kontrolle des zentralen Kohlenstoffwechsels in Hepatoma-Zellen auf Systemebene.

Die experimentelle Beobachtung der Markierungsdynamik bietet die erforderliche zeitliche Auflösung, um intrazelluläre Flussverteilungen auch in Säugetierzellen auf Grundlage von Markierungsexperimenten bestimmen zu können. Um die tracerbasierte Schätzung metabolischer Flüsse auch in Batch und Fed-Batch Fermentationen von langsam und nicht wachsenden Säugetierzellen zu ermöglichen, wurden zunächst geeignete Techniken zum gleichzeitigen Quenching des Metabolismus und zur Extraktion intrazellulärer Metabolite etabliert. Die entwickelte Probenahmetechniken und Analytikmethoden wurden dann verwendet, um Metabolitkonzentrationen und Massenfraktionen in HepG2-Zellen in einem dynamischen Markierungsexperiment mit 13C-gelabelter Glucose zu bestimmen. Zur Flussschätzung wurde ein rechenbasiertes Auswertungsrahmenwerk entwickelt. In diesem Rahmenwerk ist es möglich, metabolische Flüsse und Konzentrationen aus stationären und instationären Markierungsdaten zu schätzen. Im Rahmen der Flussschätzung wurde ein großskaliges stöchiometrisches Modell entworfen und dazu verwendet, Abflüsse in die Biomasse zu schätzen. Zur Auswertung der Markierungsdaten wurde ein Isotopomerenmodell der Glykolyse, des Pentosephosphatwegs und des Tricarbonzyklus eingesetzt. Das Verhältnis zwischen dem Fluss in die Glykolyse und in den Pentosephosphatweg wurde zu 57 % und 43 % bestimmt.

Basierend auf einem Markierungsversuch mit 13C-gelabeltem Glutamine und instationärer 13C Stoffflussanalyse wurden die Effekte einer therapeutischen Konzentration des Medikaments Atorvastatin auf die Cholesterol-Biosynthese und den Zentrallstoffwechsel von primären Rattenhepatozyten quantifiziert. Unabhängig von der Anwendung des Medikaments stellte sich isotopische Stationarität im Zentralkohlenstoffwechsel innerhalb von 4 h ein, jedoch nicht im Cholesterolstoffwechsel. Als Reaktion auf die Gabe des Medikaments sank der Fluss durch den Cholesterolweg von 0,27 auf 0,08 mmol/(lcv h). Nur unwesentliche Unterschiede wurden im zentralen Kohlenstoffwechsel zwischen Zellen festgestellt, die in 50 nM Atorvastatin kultiviert worden waren, und unbehandelten Zellen. Der Flusskontrollkoeffizient der HMG-CoA Reduktase über den Cholesterol-Synthesefluss wurde zu 0,46 bestimmt, d.h. die Cholesterol-Biosynthese wird nicht ausschließlich durch die HMG-CoA Reduktase kontrolliert. Daraus ergibt sich, dass evtl. auch andere Reaktionsschritte interessante Eingriffsmöglichkeiten zur Senkung der Blutcholesterolwerte bieten.

Ein dynamisches Model des zentralen Leberstoffwechsels wurde ausgehend von Metabolitzeitreihen entwickelt und dazu verwendet die Kontrollhierarchie in Hepatoma-Zellen aufzuklären. Die Metabolitdaten wurden in einem Stimulus-Response Experiment mit HepG2-Zellen erhoben, bei dem der Stoffwechsel durch Wegnahme der extrazellulären Glucose ausgelenkt wurde. Die Enzymkinetiken wurden durch den kanonischen Linlog-Ansatz beschrieben, der durch ein gutes Approximationsvermögen bei gleichzeitig verhältnismäßig wenig zu schätzenden Parametern charakterisiert ist. Die in silico Zeitreihen stimmten gut mit den experimentell beobachteten Stoffwechsel-Dynamiken überein. Um die interne Kontrollstruktur des zentralen Kohlenstoffwechsels in Hepatoma-Zellen aufzuklären, wurden Konzentrations- und Flusskontrollkoeffizienten sowie partielle Flusskontrollkoeffizienten und partielle interne Responsekoeffizienten bestimmt. Die gefundenen Kontrollmuster unterstützen Hypothesen nach denen sich die Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase und der Warburg-Effekt (Krebszellen haben einen erhöhten glycolytischen Fluss bei ausreichender Sauerstoffversorgung) als Targets zur Tumortherapie eignen.