Regulation des Mannose-Operons in Bacillus subtilis

Abstract

Das Mannose-Operon in B. subtilis besteht aus drei Genen, manP, manA und yjdF, von denen aber nur manP und manA für die Verwertung der Mannose notwendig sind. Stromaufwärts und in derselben Orientierung wie das Mannose-Operon liegt das regulatorische Gen manR. Dieses codiert den Transkriptionsaktivator für die Expression des Mannose-Operons und des eigenen Gens, die beide durch Mannose induzierbar sind. Mit lacZ als Reportergen verursachte die Zugabe von Mannose eine 4-7-fache Erhöhung der Transkriptionsrate des manP-Promotors (PmanP), und eine circa 3-fache Erhöhung des manR-Promotors (PmanR). Durch "Primer Extension"-Experimente wurde der Transkriptionsstart von manPA-yjdF und manR identifiziert. Die aus diesem Transkriptionsstart abgeleiteten –35- und –10-Regionen der beiden Promotoren stimmen mit der Konsensussequenz von vegetativen sA abhängigen Promotoren überein. Eine Deletion von manR bewirkte ein nahezu vollständiges Abschalten beider Promotoren. Durch Deletionsanalyse wurde die Lage der Operatorsequenz von ManR zwischen den Basenpaaren -79 und -35 bezüglich des Transkriptionsstarts von manPA-yjdF und zwischen -81 und -35 bezüglich des Transkriptionsstarts von manR bestimmt. Ein Austausch dieser Region gegen eine entsprechende Region eines Mannitol-Operons führte dazu, dass die entsprechenden Hybridpromotoren nun durch Mannitol regulierbar wurden. Eine Deletion von manP (Mannose-Transporter) hatte eine konstitutive Expression von PmanP und PmanR zur Folge. Dagegen führte eine Deletion von manA (Mannose-6-Phosphat-Isomerase) zur Sensitivität gegen Mannose. Anhand von Aminosäurensequenz-Vergleichen wurden in ManR fünf Domänen postuliert, nämlich eine N-terminale DNA-Bindedomäne, zwei PRDs, eine PTS-EIIA- und eine PTS-EIIB-ähnliche Domäne am C-Terminus. Die Deletion der EIIA- und EIIB-ähnlichen Domänen führte zu einer konstitutiven Expression von PmanP und PmanR. Da die Deletion des Gens für den Mannose-Transporter ebenfalls zur Konstitutivität führte, wurde gefolgert, dass es eine Phosphatübertragung zwischen Transporter und Regulator gibt, die die Aktivität von ManR beeinflusst. In Analogie zu anderen PRD-Regulatoren sollte die PRDI in Abwesenheit von Mannose phosphoryliert vorliegen und in Anwesenheit von Mannose durch den Mannosetransporter dephosphoryliert werden. Tatsächlich spielt wie auch bei anderen PRD-Regulatoren die PEP-abhängige Phosphorylierung an His15 von HPr eine essentielle Rolle bei der Aktivierung von PmanP und PmanR. Außerdem unterliegen sowohl PmanP als auch PmanR der Kohlenstoff-Katabolitrepression (CCR). Aufgrund der Homologie von ManR zu anderen PRD-haltigen Transkriptionsaktivatoren kann man davon ausgehen, dass die PRDII in Abwesenheit von Glucose phosphoryliert und in Anwesenheit von Glucose dephosphoryliert ist. Der Mannose-Regulator ist demnach nur aktiv, wenn PRDI dephosphoryliert und PRDII phosphoryliert ist, also wenn nur Mannose ohne Glucose im Medium vorliegt. Genau dieses Verhalten wurde an den beiden Mannose-Promotoren beobachtet. Dies überlappt mit einem zweiten, für B. subtilis bekannten Mechanismus der Katabolitrepression, dessen zentrale Bestandteile der Repressor CcpA, HPr und HPr-Kinase sind. Bei einem Überschuss an Intermediaten der Glykolyse, insbesondere Fruktose-1,6-biphosphat wird die HPr-Kinase stimuliert, die ATP-abhängig HPr an Ser46 phosphoryliert. Dieses bindet an CcpA und der Komplex bindet schließlich an sogenannte cre-Sequenzen in entsprechenden CCR-regulierten Promotoren. Tatsächlich konnte eine cre-Sequenz im manR-Promotor identifiziert werden. Eine Mutation der Sequenz führte zu einer Erniedrigung der Katabolitrepression der Mannose-Promotoren. Eine geringe Erniedrigung der CCR wurde auch in der ptsH-S46A-Mutante und einer Deletionsmutante des zu HPr homologen crh beobachtet, aber erst in der ptsH-S46A Δcrh Doppelmutante war die CCR auf PmanP and PmanR stark reduziert. Dies zeigte, dass die beiden Proteine sich offensichtlich in der Funktion komplementieren. Zusammengefasst lässt sich sagen, dass durch diese Arbeit ein autoregulatorisches System für die Mannose-Verwertung in Bacillus subtilis bezüglich Induktion und Katabolitrepression weitgehend aufgeklärt wurde und aufgrund des starken manP Promotors eine Anwendung in der Konstruktion von Expressionsvektoren finden sollte.

The mannose operon of B. subtilis consists of three genes: manP, manA and yjdF, among which only manP and manA are responsible for the utilization of mannose. Upstream and in the same orientation as the mannose operon a regulatory gene manR codes for a transcription activator of the mannose operon. Both mannose operon and manR transcription are inducible by mannose regulated by ManR. With lacZ as reporter gene the presence of mannose resulted in a 4-7-fold increase of expression rate from manP-promoter (PmanP) and 3-fold increase from manR-promoter (PmanR). The transcription start points of manPA-yjdF and manR were determined at a single A and at a single G respectively, preceded by -35 and -10 boxes resembling a vegetative sA promoter structure. A deletion of manR caused almost a complete shutdown of both promoters. Through deletion analysis the target sequences of ManR were identified between bp -79 and -35 with respect to the transcription start of manPA-yjdF and between bp -81 and -35 with respect to the transcription start of manR, respectively. An exchange of this area against another equivalent area of a mannitol operon caused that those hybrid promoters were inducible by mannitol. The deletion of manP (mannose transporter) resulted in a constitutive expression from both PmanP and PmanR. In contrast the deletion of manA (mannose-6-phosphate isomerase) led to mannose sensitivity. By protein sequence alignments a DNA binding motif at the N-terminal end, two PRDs and an EIIA- and EIIB-like domain at the C-terminal end were identified in the ManR sequence, indicating that ManR is a PRD-containing transcription activator. The deletion of EIIA- and EIIB-like domains led to a constitutive expression from both PmanP and PmanR. Since the deletion of the gene for the mannose transporter led also to a constitutive expression it was concluded that there is a phosphoryl transfer between transporter and regulator, which affects the activity of ManR. In analogy to other PRD-regulators, the PRDI should be in a phosphorylated state in absence of mannose and be dephosphorylated by the mannose transporter in presence of mannose. In fact the PEP-dependent phosphorylation by HPr via His15 plays an essential role in transcriptional activation of PmanP and PmanR. Moreover, both PmanP and PmanR are subject to carbon catabolite repression (CCR). Due to the homology of ManR to other PRD-regulators it's assumed that the PRDII is dephosphorylated in presence of glucose and phosphorylated in absence of glucose. According to that the mannose regulator is active only if PRDI is dephosphorylated and PRDII is phosphorylated, that means, when mannose is present and glucose is absent from culture media. Exactly this behaviour was observed for both promoters. This type of CCR overlaps with another well known mechanism of carbon catabolite repression in B. subtilis, whose central elements are CcpA, HPr and HPr-kinase. With an excess of intermediates of glycolysis, such as fructose-1,6-bisphosphate, the HPr-kinase is activated, in order to phosphorylate the serine 46 of HPr. The P-Ser-HPr binds to CcpA and this complex binds consequently the so-called cre sequence in those CCR regulated promoters. Actually one cre sequence was identified in PmanR. The mutation of this cre site resulted in a great relief of CCR on PmanP and PmanR. A slight decrease in CCR on PmanP and PmanR was also observed in the mutant bearing the HPr-Ser46Ala exchange and in the knockout-mutant of the HPr homologue Crh. Only in the double mutant with HPr-Ser46Ala mutation and crh-knockout the CCR on PmanP and PmanR was less distinctive. It indicates apparently that the both proteins could complement each other. Summarized, in this work an auto-regulatory system for mannose utilization in B. subtilis was elucidated extensively in respect of induction and catabolite repression. In future, the strong manR-promoter will be useful for the construction of B. subtilis expression vectors.