Die Rolle der Ser/Thr-Phosphatase PP2A in der Regulation des Transkriptionsfaktors NFkB

Abstract

Der Transkriptionsfaktor NFkB kann durch eine Vielzahl von Stimuli, wie durch das pro-inflammatorische Zytokin IL-1, aktiviert werden. NFkB ist generell dafür bekannt, dass es die Transkription von Genen verstärkt, deren Produkte das Überleben der Zelle fördern und die Apoptose inhibieren. In diesem Zusammenhang konnte beobachtet werden, dass die TRAIL-induzierte Apoptose durch eine IL-1-vermittelte NFkB-Aktivierung stark vermindert werden kann. Paradoxerweise, wird die durch UVB-Strahlung ausgelöste Apoptose durch Ko-Stimulation mit IL-1 nicht reduziert, sondern sogar noch verstärkt. Dieser Effekt konnte auf eine NFkB-abhängige Repression anti-apoptotischer Proteine und auf eine erhöhte Freisetzung des Zytokins TNF zurückgeführt werden. Sezerniertes TNF induziert durch autokrine Bindung an den TNF-R1 den apoptotischen Signalweg, wodurch die UVB-induzierte Apoptose additiv verstärkt wird. Ein Ziel dieser Arbeit war es, die molekularen Mechanismen, die für die beobachtete NFkB-abhängige Freisetzung von TNF verantwortlich sind, aufzuklären. In unstimulierten Zellen liegt NFkB, durch Bindung an IkBa, inaktiv im Zytoplasma vor. Nach der IL-1-vermittelten Phosphorylierung der Ser/Thr Kinase IKKbeta an Ser177/181 wird IkBalpha phosphoryliert, polyubiquitiniert und umgehend proteasomal degradiert. Daraufhin wird NFkB aktiviert und induziert neben seinen Zielgenen, auch die Transkription von IkBalpha. Nach kurzer Zeit beenden resynthetisierte IkBalpha-Moleküle, durch eine erneute Bindung an NFkB, dessen Aktivität. Überraschenderweise findet nach Stimulation von Zellen mit IL-1 und UVB keine Re-Synthese von IkBalpha mehr statt. Es konnte gezeigt werden, dass die daraus resultierende konstitutive Aktivierung von NFkB für eine massiv erhöhte Transkription von TNF und somit auch indirekt für dessen Sezernierung verantwortlich ist. Unsere Untersuchungen ergaben, dass die Re-Synthese von IkBalpha dadurch inhibiert wird, dass IkBalpha zwar NFkB-abhängig transkribiert, das resynthetisierte Protein aber anschließend sofort wieder phosphoryliert und proteasomal degradiert wird. Als Ursache hierfür wurde eine kontinuierliche Phosphorylierung und damit Aktivität von IKKbeta festgestellt. Verantwortlich für diese chronische IKKbeta Phosphorylierung ist die UVB-induzierte Inhibierung der Ser/Thr Phosphatase PP2A, die so als ein neuer und kritischer Modulator der IKKbeta-Aktivität identifiziert werden konnte. Die Tyrosinkinase c-Src ist an der Regulation vieler zellulärer Prozesse, die das Wachstum und das Überleben der Zelle fördern, beteiligt. Eine unkontrollierte Aktivität dieses Proto-Onkogens spielt, vorwiegend durch die Aktivierung des PI3K/Akt-, Ras/MAPK-, aber auch des NFkB-Signalweges, eine bedeutende Rolle bei der Entstehung vieler Arten von Tumoren. In der vorliegenden Arbeit konnte ein bisher unbekannter Mechanismus der Src-vermittelten konstitutiven NFkB-Aktivierung nachgewiesen werden. Unter Verwendung des Tyr-Phosphatase Inhibitors Orthovanadat kommt es in Kombination mit IL-1 Stimulation zunächst zu einer stabilen aktivierenden Tyr416 Phosphorylierung von Src. Diese wiederum inaktiviert PP2A, durch deren Phosphorylierung an Tyr307, die gleichzeitig IL-1-vermittelte IKKbeta-Aktivität verlängert wird. Folglich wird auch in diesem Fall resynthetisiertes IkBalpha phosphoryliert und proteasomal abgebaut, wodurch die NFkB-abhängige Transkription anti-apoptotischer Gene massiv verstärkt wird.

The transcription factor can be activated by a variety of stimuli, such as the pro-inflammatory cytokine IL-1. NFkB is generally known to control the expression of many genes that promote cell survival and protect cells from apoptosis. Accordingly, IL-1-mediated NFkB activation significantly reduces TRAIL-induced apoptosis. Paradoxically, UVB-induced apoptosis is not inhibited but even enhanced upon co-stimulation with IL-1. This effect was associated with NFkB-dependent repression of anti-apoptotic genes and sustained secretion of TNF which additively induces apoptosis upon autocrine activation of TNF-R1. The aim of this study was to elucidate the molecular mechanisms underlying NFkB-dependent enhancement of TNF release. In resting cells, inactive NFkB is kept in the cytoplasm by binding to its inhibitor IkBalpha. Upon stimulation with IL-1, the Ser/Thr Kinase IKKbeta becomes phosphorylated at Ser 177/181, which in turn causes phosphorylation of IkBalpha, leading to its subsequent polyubiquitination and proteasomal degradation. As a result, NFkB becomes activated and induces the transcription of target genes, including the one encoding its inhibitor IkBalpha. Newly synthesized IkBalpha consequently binds to NFkB again, thereby terminating its transcriptional activity. Surprisingly, recurrence of IkBalpha is completely blocked following co-stimulation with IL-1 and UVB, consequently leading to constitutive NFkB activation. We could show permanent NFkB activity to be a prerequisite for enhanced TNF transcription and release. Furthermore our studies revealed lack of IkBalpha recurrence not to be a result of inhibition of NFkB-dependent transcription, but to be mediated by immediate phosphorylation and proteasomal degradation of newly-synthesized IkBalpha due to persistent IKKbeta phosphorylation and activation. In this context, we revealed the Ser/Thr phosphatase PP2A to play a crucial role in the control of IKKbeta activity. Furthermore, we could show that UVB-induced inhibition of PP2A is responsible for constitutive IKKbeta phosphorylation and activation. The Tyrosine-Kinase c-Src is involved in the regulation of many cellular processes, such as growth and survival. Uncontrolled activity of the proto-oncogene Src has been linked to the development of many different types of tumors, mainly by inducing activation of the PI3/Akt, Ras/MAPK, but also the NFkB activating pathways. Utilizing the Tyr-phosphatase inhibitor orthovanadate combined with IL-1 stimulation we could demonstrate stable and activating Tyr416 phosphorylation of Src to occur. Consequently, stably activated c-Src induces the inhibitory Tyr307 phosphorylation of PP2A, thereby maintaining the IL-1-mediated activity of IKKbeta. Accordingly, also under these circumstances, resynthesized IkBalpha undergoes phosphorylation and proteasomal degradation, finally leading to a strong increase of NFkB-dependent transcription of anti-apoptotic genes.