A soluble TNF receptor 2 agonist as a new therapeutic approach to treat autoimmune and demyelinating diseases

Abstract

Tumor necrosis factor (TNF) exerts its biological functions via two distinct receptors. Whereas the TNF receptor (TNFR) 1 mainly mediates inflammatory responses, the TNFR2 is involved in tissue protection and regeneration. Accordingly, TNF variants selectively activating TNFR2 could potentially be useful as therapeutic regimen in a variety of diseases. In this study, there was developed a TNFR2-specific agonist, which may be a promising therapeutic in immune- and neurodegenerative diseases. In addition, the molecular mechanisms of TNFR2 signaling and turnover at the membrane were further unrevealed. Endocytosis is an important mechanism to regulate TNF signaling. In contrast to TNFR1, the relevance of receptor internalization for signaling as well as the fate and route of internalized TNFR2 is poorly understood. Upon generation of a human TNFR2-expressing mouse embryonic fibroblast cell line in a TNFR1-/-/TNFR2-/--background, I could demonstrate that TNFR2 was internalized together with its ligand and cytoplasmic binding partners. The internalization was dependent on a di-leucin motif in the cytoplasmic part of TNFR2 and the colocalization of the receptor-complex with clathrin suggested clathrin-mediated internalization of TNFR2. Internalization-defective TNFR2 mutants were capable to signal, i.e. activate NFkB, demonstrating that the di-leucin motif-dependent internalization is dispensable for this response. Therefore receptor internalization primarily seems to serve as a negative feed-back to limit TNF responses via TNFR2. Soluble recombinant TNF is a strong mediator of inflammation, predominantly through TNFR1 activation, as soluble TNF is not sufficient to activate TNFR2. In contrast, the membrane-bound form of TNF (memTNF) fully activates both TNFRs. Therefore, TNFR2-specific therapeutics need to comply with two basic requirements: mimicry of memTNF and, in order to avoid dose limiting severe inflammatory responses, receptor selectivity. As a basis for the construction of a memTNF-mimetic, TNFR2-selective TNF variant, a single-chain TNF (scTNF) molecule was used, that consists of three TNF monomers fused by short peptide linkers. Introducing two amino acid exchanges (D143N/A145R) into a scTNF variant resulted in the loss of TNFR1 affinity under retention of TNFR2 binding. To mimic memTNF, such a receptor-selective single-chain TNF (scTNFR2) was linked to the tenascin C (TNC) trimerization domain, resulting in stabilized TNC-scTNFR2 nonamers with respect to the TNF domains. In vitro TNC-scTNFR2 demonstrated memTNF-mimetic activity and exclusively activated TNFR2. TNC-scTNFR2-enhanced T cell activation was shown by the increased interleukin 2-dependent interferon gamma production. More revealing, TNC-scTNFR2 increased the number of regulatory FoxP3+/CD25+ T cells in cultures of human peripheral blood mononuclear cells, suggesting a potential role in downregulation of T cell immune responses. In cultures of primary astrocytes TNC-scTNFR2 induced the upregulation of ciliary neurotrophic factor, a neurotrophic factor, which enhances the formation of myelin. In addition, in in vitro cultures, TNC-scTNFR2 rescued differentiated neurons from hydrogen peroxide-induced cell death. First in vivo studies on the pharmacokinetic behavior and potential systemic responses in huTNFR2-transgenic mice revealed that compared to TNF, TNC-scTNFR2 has a dramatically extended plasma half-life, yet shows no signs of systemic toxicity and thus is well tolerated even at doses several fold above the MTD of wildtype TNF. These results warrant further studies on the therapeutic usefulness of TNC-scTNFR2 in appropriate animal models of autoimmune and neurodegenerative diseases.

Der Tumornekrosefaktor (TNF) kann mit zwei unterschiedlichen Rezeptoren interagieren. Dabei vermittelt der TNF Rezeptor (TNFR) 1 vor allem Entzündungsreaktionen, wohingegen der TNFR2 an der Gewebeprotektion und Regeneration beteiligt ist. Demzufolge könnten TNF-Varianten, die selektiv den TNFR2 aktivieren, potentiell als Therapeutika in verschiedenen Krankheiten verwendet werden. In dieser Arbeit wurde ein TNFR2-spezifischer Agonist entwickelt, der einen vielversprechenden Ansatz zur Behandlung von immunologischen und neurodegenerativen Erkrankungen bieten kann. Zusätzlich wurden die molekularen Mechanismen der TNFR2 Signaltransduktion und der Umsatz an der Membran weiter aufgeklärt. Ein wichtiger Mechanismus zur Regulation der Signaltransduktion von TNF ist die Endozytose des Ligand/Rezeptor-Komplexes. Im Gegensatz zum TNFR1 ist die Bedeutung der Rezeptorinternalisierung für die Signaltransduktion, sowie der Internalisierungsweg und das Schicksal des TNFR2 nur ungenügend verstanden. In einer embryonalen Fibroblasten Zelllinie aus TNFR1-/-/TNFR2-/--Mäusen, die den humanen TNFR2 exprimiert, konnte ich zeigen, dass der TNFR2 zusammen mit seinem Liganden und zytoplasmatischen Bindungspartnern internalisiert wird. Die Internalisierung war abhängig von einem Di-Leucin Motiv im zytoplasmatischen Teil des TNFR2. Die Kolokalisation des TNFR2 mit Clathrin legt eine Clathrin-vermittelte Internalisierung des TNFR2 nahe. Internalisierungsdefekte Mutanten des TNFR2 konnten Signale transduzieren, z.B. NFkB aktivieren, was darauf hinweist, dass die Di-Leucin Motiv abhängige Internalisierung für diese zelluläre Antwort nicht benötigt wird. Die Internalisierung des Rezeptors dient deshalb primär als negative Rückkopplung, um TNF-Antworten über den TNFR2 zu limitieren. Lösliches rekombinantes TNF (sTNF) ist ein starker Mediator von Entzündungsreaktionen. Da sTNF den TNFR2 nicht effizient aktiviert, wird diese biologische Antwort überwiegend durch den TNFR1 vermittelt. Im Gegensatz dazu aktiviert die membrangebundene Form von TNF (memTNF) sowohl den TNFR1 als auch den TNFR2. Demzufolge müssen Therapeutika, die spezifisch den TNFR2 aktivieren, zwei grundlegende Voraussetzungen erfüllen: Sie müssen zum Einen memTNF nachahmen und zum Anderen, um dosislimitierende, schwerwiegende Entzündungsreaktionen zu vermeiden selektiv nur den TNFR2 aktivieren. Als Grundlage zur Konstruktion einer löslichen memTNF-mimetischen und TNFR2-selektiven TNF-Variante wurde ein single-chain TNF (scTNF), welches aus drei TNF Monomeren besteht, die über kurze Peptid-Verknüpfungen verbunden sind, benutzt. Der Austausch von zwei Aminosäuren (D143N/A145R) in einer solchen scTNF-Variante führte zum Verlust der Affinität für den TNFR1, wobei die Binding an den TNFR2 nicht beeinflusst wurde. Um memTNF nachzuahmen, wurde ein TNFR2-selektives scTNF (scTNFR2) mit der Trimerisierungsdomäne des Tenascin C (TNC) verbunden. Dies führte zu einem stabilisierten TNC-scTNFR2-Nonamer, bezogen auf die TNF-Domänen. In vitro konnte gezeigt werden, dass TNC-scTNFR2 memTNF-mimetische Aktivität besitzt und ausschließlich den TNFR2 aktiviert. Mit der verstärkten Interleukin-2-abhängigen Sekretion des Gamma-Interferons konnte gezeigt werden, dass TNC-scTNFR2 zur Aktivierung von T-Zellen beiträgt. Insbesondere, weist die durch TNC-scTNFR2 erhöhte Anzahl an regulatorischen FoxP3+/CD25+ T-Zellen in Kulturen von humanen mononukleären Zellen des peripheren Blutes darauf hin, dass der TNFR2 potentiell eine Rolle bei der Suppression von T-Zell-vermittelten Immunantworten spielt. In Kulturen von primären Astrozyten erhöhte TNC-scTNFR2 die Expression des „Ciliary Neurotrophic Factor”, einem neurotrophen Faktor, welcher die Myelinbildung verstärkt. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass TNC-scTNFR2 in in vitro Kulturen differenzierte Neuronen vor dem durch Wasserstoffperoxid induzierten Zelltod schützt. Erste in vivo Studien zur Pharmakokinetik und potentiellen systemischen Effekten in huTNFR2-transgenen Mäusen ergaben, dass TNC-scTNFR2, verglichen mit TNF, eine drastisch erhöhte Plasma-Halbwertszeit zeigt und dennoch keine Zeichen von akuter systemischer Toxizität aufweist. TNC-scTNFR2 wird deshalb auch in Dosen, die deutlich über der maximal tolerierten Dosis des Wildtyp-TNFs liegen toleriert. Diese Resultate bilden die Grundlage, um weiterführende Studien zum therapeutischen Nutzen von TNC-scTNFR2 in geeigneten Tiermodellen von Autoimmun- und neurodegenerativen Erkrankungen durchzuführen.