The use of rolling circle amplification (RCA) for diagnosis and characterization of geminiviruses

Abstract

Geminiviridae is the largest family of plant DNA viruses that infect a broad range of plants causing a limitation to the production of economically important or staple food crops within tropical and subtropical countries. Increasing knowledge about its epidemiology, sequence diversity and biodiversity is highly important in order to implement preventative strategies. With the use of rolling circle amplification (RCA) combined with restriction fragment length polymorphism (RFLP), in addition to other methods applied in molecular biology, technical improvements on direct sequencing, shot gun cloning and pyrosequencing were achieved in this work. In the first two parts of this study RCA/RFLP was used to diagnose geminiviral infection in symptomatic plant samples originally collected in South America. All samples from Bolivia, in total 7 weeds and 21 of 22 samples from Brazil, including beans samples, were diagnosed virus positive when analyzed using RCA/RFLP. RCA products were sequenced using two different methods and the complete genome sequences of all detected viruses were obtained. For the Bolivian samples, a novel and efficient cloning strategy with tandem repeat inserts obtained by limited Sau3AI digestion was used and for the Brazilian samples, in order to develop a faster detection and characterization system for geminiviral infection, the RCA products were pooled and sequenced by the commercially available 454 method. The sequences analysis showed that all viruses had a genomic organization of bipartite New World begomoviruses. Phylogenetic analysis revealed amongst the detected viruses, five distinct new virus species, two new strains and five variants of previously described viruses. In the third part of the study, two variants of Tomato golden mosaic virus (TGMV), common strain (cs) and yellow vein (yv), originally extracted from tomato but never detected in tomatoes again, were completely sequenced for the first time and successfully bombarded back into tomato plants. The infection rate was extremely low and symptoms induction was very mild. Finally, in the last part of this work, Asystasia gangetica plants, collected in West Africa in the 1980s with segregation of symptoms, including mosaic and yellow veining, typical of geminiviral infections were analyzed. Also in this case using the RCA/RFLP technique followed by deep sequencing of the RCA products, the results confirm the idea of infection by two distinct geminiviruses, showing a remarkable segregation of geminiviruses in a single plant.

Geminiviridae ist die größte Familie der phytopathogenen DNA-Viren, die eine Vielzahl an Nutzpflanzen infizieren. Hierbei verursachen sie erhebliche Einbußen bei der Produktion von wirtschaftlich bedeutsamem Ausmaß. Der Eigenbedarf an Ernteerträgen zur Sicherung der Existenz in den Tropen und Subtropen ist dadurch gefährdet. Zunehmendes Wissen über Epidemiologie, Sequenz- und Bio-Diversität ist daher überaus bedeutend, um vorbeugende Strategien zu bewerkstelligen. In dieser Arbeit wurde die Rolling-Circle-Amplifikation (RCA) in Kombination mit dem Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) zusätzlich zu anderen, in der Molekularbiologie angewandten Methoden, zur technisch entscheidenden Verbesserung der direkten Sequenzierung, der biolistischen Klonierung und der Pyrosequenzierung genutzt. In den ersten zwei Teilen dieser Studie wurde die RCA/RFLP angewandt, um symptomatische Pflanzenproben aus Südamerika auf eine geminivirale Infektion hin zu untersuchen. So wurden alle Proben, insgesamt sieben Unkraut- aus Bolivien und 21 von 22 Nutzpflanzen (u.a. Bohnen) aus Brasilien, als viruspositiv diagnostiziert. Zudem wurden die RCA-Produkte unter Verwendung von zwei verschiedenen Methoden sequenziert. Hierfür wurde für die bolivianischen Proben eine neuartige und sehr effiziente Klonierungsstrategie genutzt, bei der die zu inserierende DNA als Tandem-Wiederholung über limitierte Restriktion mit Sau3AI generiert wurde. Bei den brasilianischen Proben wurden die RCA-Produkte gemischt und über die kommerziell erhältliche Methode 454 sequenziert, um ein schnelles Detektions- und Charakterisierungssystem zu entwickeln. Mit Hilfe dieser Methoden wurden die vollständigen Sequenzen der Genome aller nachgewiesenen Viren ermittelt. Die Analyse der Sequenzen ergab, dass alle diese Viren Neuwelt-Begomoviren mit einer bipartiten Genomorganisation sind. Dies wurde weiterhin mittels phylogenetischer Analyse bestätigt. Hierdurch wurden fünf neue Virusspezies, zwei neue Stämme sowie fünf neue Varianten, die zu bereits beschriebenen Viren gehören, nachgewiesen. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden zwei Varianten des Tomato golden mosaic virus, common strain (cs) und yellow vein (yv), die anfänglich aus Tomatenpflanzen isoliert wurden, aber zu keiner Zeit wieder in Tomaten nachweisbar waren, komplett sequenziert und überdies erfolgreich mittels Partikelbeschuss in Tomaten zurückgeführt. Diese induzierten nur milde Symptome mit einer extrem niedrigen Infektionsrate. Im letzten Teil dieser Arbeit wurden die in den Achtzigerjahren in Westafrika gesammelten Asystasia gangetica Pflanzenproben analysiert. Diese zeigten Symptomsegregation mit Blattmosaik und Vergilbung der Blattadern, die auf zwei verschiedene geminivirale Infektionen zurückzuführen sind. Eine Analyse der RCA-Produkte mittels an die RCA/RFLP-Technik angeschlossenes deep sequencing bekräftigte die Annahme, dass diese Pflanzen tatsächlich mit zwei verschiedenen Geminiviren infiziert waren, die zu einer beträchtlichen Segregation in derselben Pflanze führten.